產(chǎn)前暴露于納米氧化鋅對(duì)大鼠子代腦發(fā)育及成年期行為學(xué)特性的影響.pdf

1、對(duì)納米材料生物安全性的研究已經(jīng)引起了全世界的廣泛關(guān)注。納米材料在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)傳統(tǒng)口腔材料的改性和創(chuàng)新具有重要意義。本研究設(shè)想通過建立產(chǎn)前暴露于納米氧化鋅的胎鼠模型，檢測(cè)新生乳鼠腦組織的結(jié)構(gòu)及相關(guān)生化指標(biāo)的水平，探討納米氧化鋅神經(jīng)毒性的具體表現(xiàn)及主要毒性機(jī)制，并對(duì)子代大鼠進(jìn)行成年期的行為學(xué)分析，以探討其學(xué)習(xí)記憶行為方式的改變。
　　目的：
　　1.觀察妊娠期經(jīng)口染毒的納米氧化鋅穿越母鼠的胎盤屏障進(jìn)入胎鼠體內(nèi)，分布至胎

2、鼠腦組織及全身其他臟器的情況。
　　2.研究納米氧化鋅的產(chǎn)前暴露對(duì)子代大鼠腦組織發(fā)育產(chǎn)生的不良影響。
　　3.探討納米氧化鋅導(dǎo)致神經(jīng)毒性的相關(guān)作用機(jī)制。
　　4.探討納米氧化鋅的產(chǎn)前暴露對(duì)子代大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　方法：
　　納米氧化鋅的材料表征
　　1)透射電子顯微鏡檢測(cè)納米顆粒的原始粒徑和形狀。
　　2)動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米顆粒在水溶液中的粒徑分布和電位值。
　　3)能譜

3、儀檢測(cè)納米顆粒的化學(xué)元素含量。
　　4)X線衍射儀檢測(cè)納米顆粒的晶體構(gòu)象。
　　5) N2吸附BET法檢測(cè)納米顆粒的比表面積。
　　6)鱟試劑凝膠法檢測(cè)納米顆粒的內(nèi)毒素水平。
　　7)電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)納米顆粒在人工胃液中的溶解度。
　　動(dòng)物模型的建立及腦損傷指標(biāo)的研究
　　1)動(dòng)物模型的建立
　　造模前用含有0.05％(v/v)吐溫80的生理鹽水將納米氧化鋅顆粒分散均勻，然后對(duì)妊娠期第3

4、d至第20 d的SD大鼠進(jìn)行樣品混懸浮液(500 mg/kg體重)的灌胃處理，給與對(duì)照組的大鼠相同體積生理鹽水的灌胃處理。
　　2)主要器官的比重系數(shù)
　　分別選取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中出生第2d的乳鼠，測(cè)量體重后將乳鼠斷頸處死。即刻收集乳鼠的心、肝、脾、肺、腎及腦組織，測(cè)量重量后計(jì)算各器官的比重系數(shù)。
　　3)鋅元素的生物學(xué)分布
　　收集出生第2d乳鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦組織，以及出生21 d的乳鼠和母鼠的血液，

5、用硝酸及H2O2溶液消化，直至組織和血液消化完全，采用ICP-MS檢測(cè)各樣品中Zn元素的含量。
　　4)腦組織的病理改變
　　收集出生第2d乳鼠的腦組織，用4％的福爾馬林浸泡完全后，制作石蠟切片。常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察腦組織的病理改變。此外，分別采用Ki-67、TUNEL免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察神經(jīng)細(xì)胞的增殖及凋亡情況。
　　5)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變
　　將收集到的新鮮腦組織立即浸泡在3％的戊二醛溶液中，

6、固定完全后制作環(huán)氧樹脂包埋塊，常規(guī)染色后采用TEM觀察納米顆粒在腦組織中的定位及神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　納米氧化鋅神經(jīng)毒性的機(jī)制研究
　　1)組織勻漿的制備及蛋白濃度的測(cè)定
　　分別收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中，出生第2d乳鼠的新鮮腦組織，用組織勻漿機(jī)絞碎制備組織勻漿，離心后收集上清液，按要求稀釋成不同濃度。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)試劑盒的說明，檢測(cè)上清液中的蛋白濃度。
　　2)活性氧(ROS)含量的檢測(cè)
　　選擇適當(dāng)

7、濃度的勻漿上清液，按照ROS試劑盒的要求，將樣品和相關(guān)試劑加于避光96孔板中，反應(yīng)完全后用熒光酶標(biāo)儀讀取各孔的吸光度(OD)值，并計(jì)算結(jié)果。
　　3)氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的改變
　　選擇適當(dāng)濃度的勻漿上清液，分別按照超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒的要求，將樣品及相關(guān)試劑加于96孔板中，反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀讀取各孔的OD值，并計(jì)算結(jié)果。
　　4)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量
　　選擇適當(dāng)濃度

8、的勻漿上清液，按照丙二醛(MDA)試劑盒的要求，將樣品及相關(guān)試劑加于96孔板中，反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀讀取各孔的OD值，并計(jì)算結(jié)果。
　　5)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)
　　收集不同組出生第2d及21d乳鼠的腦組織，制作組織勻漿后，提取總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因，如SOD、Gsr、Gstt1、Alox12b等表達(dá)水平的改變。選擇大鼠的β-actin基因作為內(nèi)參。

9、>　　子代大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶功能的研究
　　1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的挑選
　　實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的新生乳鼠均由母鼠喂養(yǎng)至21d大時(shí)斷奶，按性別分籠飼養(yǎng)，養(yǎng)育至2個(gè)月大時(shí)進(jìn)行水迷宮行為測(cè)試。
　　2)水迷宮實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)期
　　圓形平臺(tái)的高度位于泳池內(nèi)水面下方1-2 cm處。將大鼠依次從平臺(tái)的四個(gè)象限放入，記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間。在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)的大鼠，將其人為引導(dǎo)至平臺(tái)上并停留15s。每只大鼠每天練習(xí)4輪，持續(xù)5d。
　

10、　3)水迷宮實(shí)驗(yàn)的探索期
　　移走水下平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限放入，記錄60 s內(nèi)，大鼠在原平臺(tái)所在象限的探索時(shí)間，及大鼠穿過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。
　　4)水迷宮實(shí)驗(yàn)的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)期
　　將平臺(tái)放回水池另一象限（不同于原象限）的中央，同學(xué)習(xí)期，將大鼠分別從水池的四個(gè)象限放入水中，記錄其找到新平臺(tái)的時(shí)間。在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)的大鼠，將其引導(dǎo)至平臺(tái)上并停留15s。每只大鼠每天練習(xí)4輪，持續(xù)2d。
　　結(jié)

11、果：
　　1.TEM顯示納米氧化鋅顆粒的原始粒徑在50 nm左右，形狀為長的六邊形顆粒。DLS顯示納米顆粒在pH7.0的水溶液中，粒徑主要分布在500.8 nm左右，Zeta電位是32.9 mV。EDS及XRD結(jié)果表明納米顆粒的元素組成及晶體構(gòu)象符合氧化鋅特點(diǎn)。N2吸附BET分析顯示其比表面積為32.17 m2/g。凝膠法檢測(cè)提示納米顆粒未含有明顯內(nèi)毒素。
　　2.ICP-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在人工胃液(pH=1.5)中孵育12

12、h，超過70％的納米氧化鋅顆粒已發(fā)生溶解。繼續(xù)孵育至48 h時(shí)，納米顆粒的溶解度基本穩(wěn)定，最終達(dá)到77.4％。
　　3.實(shí)驗(yàn)組中新生乳鼠的體重為6.83±0.65 g，對(duì)照組中新生乳鼠的體重為7.72±0.33g，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。此外，實(shí)驗(yàn)組乳鼠的心、肝、腦的比重系數(shù)顯著高于對(duì)照組，脾和腎的比重系數(shù)顯著低于對(duì)照組。肺的比重系數(shù)兩組無顯著差異。
　　4.生物學(xué)分布檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Zn元素在實(shí)驗(yàn)組乳鼠的心、肝、腎及腦組織的含量顯

13、著高于對(duì)照組，在脾和肺中兩組的含量無明顯差異。出生21 d的乳鼠及母鼠的血液中，Zn元素在實(shí)驗(yàn)組的含量略高于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.腦組織的病理切片顯示，實(shí)驗(yàn)組乳鼠的腦組織中，部分區(qū)域出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)疏松。免疫組化的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組乳鼠的腦細(xì)胞Ki-67陽性率顯著下降，而TUNEL染色陽性率明顯上升。
　　6.TEM觀察到實(shí)驗(yàn)組大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的改變，包括細(xì)胞膜完整性下降，線粒體腫脹，甚至出現(xiàn)

14、自噬體。此外，在神經(jīng)突觸中可以看到大量的納米顆粒聚集。
　　7.生化檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組乳鼠的腦組織中ROS含量為12485.56±1435.13 FI/mgprotein，明顯高于對(duì)照組。而抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性顯著低于對(duì)照組。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量明顯上升至16.62±2.75 nmol/mg protein。
　　8.qRT-PCR結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)組乳鼠的腦組織中，氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變。檢測(cè)的

15、8個(gè)基因中，在乳鼠出生第2d時(shí)，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。在乳鼠出生第21d時(shí)，5個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，3個(gè)基因發(fā)生下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.各種表征手段明確了實(shí)驗(yàn)用納米顆粒的粒徑、電位、化學(xué)成分、晶體構(gòu)象及比表面積等理化性質(zhì)。內(nèi)毒素測(cè)試的結(jié)果可進(jìn)一步排除納米顆粒本身含有的內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。溶解測(cè)試提示經(jīng)口染毒的納米顆粒在胃酸的消化作用下，會(huì)發(fā)生較大程度的溶解。
　　2.納米氧化鋅的產(chǎn)前暴露會(huì)引起胚胎期的大鼠生長受限，同時(shí)導(dǎo)

16、致新生乳鼠各器官的比重系數(shù)發(fā)生改變，提示各組織器官出現(xiàn)炎癥等損傷效應(yīng)。
　　3.對(duì)妊娠期母鼠進(jìn)行納米氧化鋅顆粒的灌胃處理，納米顆粒在胃液強(qiáng)酸性的環(huán)境中會(huì)發(fā)生溶解，部分游離出來的Zn離子和納米顆粒會(huì)隨血液穿越胎盤屏障及胎鼠的血腦屏障，在胎鼠的腦組織及其他器官中發(fā)生二次聚集，導(dǎo)致各器官Zn元素的含量顯著上升。然而，隨著納米顆粒從體內(nèi)排出，及繼續(xù)分布至各組織中，血液中的Zn元素含量會(huì)逐步下降，并達(dá)到最初的穩(wěn)定水平。
　　4.納米顆

17、粒的產(chǎn)前暴露會(huì)影響胎鼠的腦發(fā)育，在一定程度上導(dǎo)致新生乳鼠的腦組織結(jié)構(gòu)疏松，并出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞增值率下降，凋亡率上升的病變。
　　5.納米氧化鋅神經(jīng)毒性的作用機(jī)制，與其引起的腦組織內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡有密切關(guān)系。進(jìn)入腦組織后，納米顆粒會(huì)導(dǎo)致組織中ROS含量上升，過量的氧自由基會(huì)攻擊脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并且引起抗氧化酶活性下降。
　　6.納米氧化鋅的暴露同時(shí)導(dǎo)致腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變。相對(duì)于發(fā)育早期的新生乳鼠，更多相關(guān)基