新型殼聚糖精氨酸衍生物基因載體的構(gòu)建及其基因傳遞效率的研究.pdf

1、殼聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性、生物降解性及優(yōu)越的復(fù)合壓縮DNA的能力，在基因載體領(lǐng)域中被廣泛關(guān)注。但殼聚糖較差的溶解性及其較低的基因轉(zhuǎn)染效率在很大程度上限制了其深入開發(fā)和應(yīng)用。如何提高其基因傳遞效率，一直是研究者們亟待解決的難題。本研究利用精氨酸及聚精氨酸對殼聚糖進(jìn)行了改性，制備了（聚）精氨酸改性的殼聚糖，繼而將其與質(zhì)粒復(fù)合構(gòu)建了復(fù)合納米粒子，對納米粒子的理化特征和基因傳遞效率進(jìn)行了系統(tǒng)研究與分析。
　　首先，以殼聚糖為原

2、料與精氨酸及五肽精氨酸按一定配比進(jìn)行反應(yīng)，得到精氨酸-殼聚糖和五肽精氨酸-殼聚糖產(chǎn)物。所得產(chǎn)物采用1H NMR核磁對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。然后，將兩種產(chǎn)物通過靜電作用和質(zhì)粒復(fù)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合粒子，對復(fù)合粒子的形貌特征、Zeta電位、緩沖能力進(jìn)行研究和分析，并通過凝膠阻滯實驗研究其復(fù)合能力及DNaseⅠ保護能力。最后，按不同的N/P比構(gòu)建復(fù)合粒子，使用HEK-293人胚腎上皮細(xì)胞對復(fù)合粒子的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，并對其入胞效率、入胞途徑及體外

3、基因傳遞效率進(jìn)行了系統(tǒng)研究與分析。
　　實驗結(jié)果表明，成功制得殼聚糖的衍生物CS-Arg和CS-5Arg，其取代度分別為6.45％和4.90％，分子量分別為21.0k和23.8 k。改性后的殼聚糖具有良好的DNA復(fù)合和壓縮能力，均可以同DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合粒子，復(fù)合粒子直徑在100nm左右，平均高度在6-8 nm，形態(tài)分布較均勻，符合納米粒子的特性。改性后殼聚糖的緩沖能力較殼聚糖有明顯提高，其中精氨酸修飾后的殼聚糖緩沖能力為殼聚糖

4、的四倍，五肽精氨酸修飾后的殼聚糖緩沖能力為殼聚糖的兩倍。電位測定結(jié)果顯示經(jīng)（聚）精氨酸修飾的殼聚糖電荷分布在+21至+31 mV范圍內(nèi)，具有較理想的結(jié)合帶負(fù)電的質(zhì)粒的電位電勢值。凝膠阻滯實驗結(jié)果表明，CS-Arg、CS-5Arg分別在N/P比8與6時可與質(zhì)粒完全復(fù)合，具有良好的質(zhì)粒包覆作用。DNaseⅠ保護實驗表明，CS-Arg/pDNA、CS-5Arg/pDNA復(fù)合粒子在1U和2U濃度的DNaseⅠ中具有良好的酶保護作用，可避免DNA

5、被DNaseⅠ降解，比殼聚糖具有更為優(yōu)良的酶保護性能。
　　體外轉(zhuǎn)染試驗中，使用HEK-293細(xì)胞株，CCK-8法研究細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示CS-Arg、CS-5Arg與CS-Arg/pDNA、CS-5Arg/pDNA納米粒子均無細(xì)胞毒性，（聚）精氨酸修飾殼聚糖的各組與未經(jīng)修飾的殼聚糖對照組無顯著性差異;細(xì)胞內(nèi)吞實驗中，細(xì)胞對復(fù)合粒子的吞噬情況具有顯著的時間依賴性，CS-Arg、CS-5Arg較殼聚糖具有更高效的協(xié)助質(zhì)粒入胞的特性;體

6、外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過（聚）精氨酸接枝后的殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率得到的較大程度的提高，與陽性對照PEI的轉(zhuǎn)染效果接近，但CS-Arg與CS-5Arg二者間無顯著組間差異;復(fù)合粒子的胞內(nèi)示蹤實驗結(jié)果顯示，大多數(shù)的復(fù)合粒子都可以順利地進(jìn)入到胞內(nèi)，并且在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有復(fù)合粒子的分布，且觀察到復(fù)合粒子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生解離。
　　研究結(jié)果表明，（聚）精氨酸對殼聚糖改性是一種有效提高基因轉(zhuǎn)染效率的方法，可為殼聚糖基納米粒子作為基因載體用于基因