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文檔簡介
1、目的:
在許多實(shí)體腫瘤中,對(duì)表面標(biāo)志物的表達(dá)以及倍體分析的技術(shù)(SET-iFISH檢測(cè)技術(shù))已被證實(shí)成為檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)的敏感性很高的方法,而在乳腺癌特別是原發(fā)性乳腺癌中的相關(guān)研究甚少。因此我們通過SET-iFISH檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌中的CTCs,并通過細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)以及倍體的表達(dá)情況來得出CTCs亞型的特征,從而分析乳腺癌中的CT
2、Cs及其相關(guān)特性,以期為乳腺腫瘤的早期監(jiān)測(cè)、腫瘤分子分型、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后指導(dǎo)、腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、個(gè)體化治療等一系列過程提供更為精確有力的檢測(cè)手段。
方法:
在2014.02至2015.06間,我們?nèi)虢M了長海醫(yī)院甲乳外科184例原發(fā)性乳腺癌患者,26例乳房良性腫瘤患者及10例健康志愿者。在該研究中分別抽取以上患者及健康志愿者的未經(jīng)任何治療的外周血樣本。所有項(xiàng)目均可提供知情同意書,該試驗(yàn)經(jīng)過長海醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過且根據(jù)赫
3、爾辛基宣言的原則進(jìn)行。
該試驗(yàn)參考了相關(guān)臨床試驗(yàn)以及制造商的說明(Cytelligen,San Diego,CA,USA)[3、15]。首先,用ACD抗凝管(Becton Dickinson,F(xiàn)ranklin Lakes,NJ,USA)采集7.5ml患者血樣本,然后與3ml hCTC分離介質(zhì)充分混勻,在室溫下用450×g進(jìn)行離心5分鐘。免疫磁性微粒偶聯(lián)抗白細(xì)胞單克隆抗體包括抗CD45抗體后緩慢振蕩10分鐘并提取上層清液并培養(yǎng)。
4、隨后用一種磁性分離技術(shù)(Promega,Madison,WI)去除白細(xì)胞,在室溫下磁性顆粒以500×g緩慢離心2分鐘。細(xì)胞顆粒在細(xì)胞固定劑中徹底重懸并覆蓋于CTC表面而后被應(yīng)用到后續(xù)iFISH的分析。對(duì)于CK-iFISH方法,樣本由Alexa Fluor594-共軛單克隆抗CD45和Alexa Fluor488-共軛抗PanCK(CK4、5、6、8、10、13及18)或抗人表皮生長因子受體2(human epidermal growth
5、 factor receptor-2,HER2)的聯(lián)合抗體在黑暗中聯(lián)合免疫標(biāo)記1小時(shí),使用FISH技術(shù)S500 StatSpinThermoBrite Slide雜交/變性系統(tǒng)(Abbott Molecular, Des Plaines,IL,USA)的8號(hào)染色體著絲粒探針8(CEP—8) SpectrumOrange(Vysis, Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,USA),非整倍體上DAPI+/C
6、D45-/PanCK+/-/HER2+者被認(rèn)為是CTCs。
采用SPSS19.0(IBM,NY, USA)的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用U檢驗(yàn)對(duì)乳腺癌,乳房良性疾病及健康志愿者之間CTCs數(shù)量的不同進(jìn)行分析。包含或不包含CK表達(dá)的CTCs陽性率由Fisher's精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用OriginPro8 SR08.0版(Northampton,MA,USA)進(jìn)行圖表生成。所有的檢測(cè)數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),且認(rèn)為P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)
7、意義(P<0.05)。
結(jié)果:
1.CTCs與乳腺癌
在2014.02至2015.06間,總共入組了上海市長海醫(yī)院甲乳外科184例原發(fā)乳腺癌患者,26例乳房良性腫瘤患者及10例健康志愿者。184例乳腺癌患者中167例可檢測(cè)到非整倍體CTCs(90.76%),其中CTC的數(shù)量為0-19/7.5ml血(均值2)。檢測(cè)出的CTC總數(shù)為676,其中三倍體的數(shù)量為387(57.25%),來源于147例患者(147/1
8、67,79.89%)。而其中僅18例患者(18/167,10.78%)中的33個(gè)CTC被檢出CK+(4.88%)。26例良性腫瘤中8例(30.77%)可檢測(cè)出非整倍體CTC,明顯少于乳腺癌患者(P=0)。此外,良性腫瘤中CTC的檢出率均<3/7.5ml血。而健康志愿者的血樣本中均未檢測(cè)出CTC。
2.CTCs與腫瘤大小
在184例被檢測(cè)的乳腺癌樣本中,158例的腫瘤大小可測(cè)量。其中根據(jù)腫瘤直徑的最大徑來看,80例≤2
9、cm(歸為T1期),68例>2 cm且≤5cm(歸為T2期),而10例>5cm(歸入T3期)。盡管T3期的患者所占比例少,但其在組間CTC的檢出率最多(0-18,均值5.5)。三倍體CTC的數(shù)量在T3期和T1/T2期患者中明顯不同,均值分別為4、1.5和1(P=0.048,P=0.006)。基于CK表達(dá)不同的CTC亞型在T1、T2及T3期患者中無顯著差異。
3.CTCs與乳腺癌分子分型[17]
在184例乳腺癌樣本中
10、,166例的激素受體狀態(tài)已知。其中根據(jù)乳腺癌分子分型來看,30例屬于Luminal A型(ER+和/或PR+,且HER2-,且Ki-67<14%=,89例為Luminal B型(ER+和/或PR+,且HER2+; ER+和/或PR+,且HER2-,且Ki-67≥14%),35例HER2陽性型(ER-且PR-且HER2+),以及12例三陰性(ER-且PR-且HER2-)。發(fā)現(xiàn)存在CTCs的人數(shù)中,LuminalA型占30例中的28例(80
11、%),數(shù)值范圍為0-18/7.5ml血(均值2),Luminal B型的患者中占89例的80例(89.9%),數(shù)值范圍為0-19/7.5ml血(均值2),而在HER2陽性型患者中占35例中的34例(97.1%),數(shù)值范圍為0-15/7.5ml血(均值4),另外三陰性患者12例均發(fā)現(xiàn)CTCs的存在(100%),數(shù)值范圍在0-12/7.5ml血(均值2.5)。HER2陽性型和三陰性的乳腺癌患者與Luminal A型和Luminal B型者相
12、比,檢測(cè)到CTCs的頻率及數(shù)量均相對(duì)較高。
CTCs亞型基于染色體核型,包括三倍體,四倍體及其他多倍體(≥5),能在不同激素受體狀態(tài)的乳腺癌中體現(xiàn)類似的分布。而CK+的CTCs主要存在于Luminal A和Luminal B的患者中。
結(jié)論:
SET-iFISH系統(tǒng)可用于檢測(cè)非轉(zhuǎn)移性的不依賴CK表達(dá)的乳腺癌CTCs。CTCs存在與否及其數(shù)量與乳腺癌的腫瘤大小以及激素受體狀態(tài)密切相關(guān)。而在不考慮腫瘤大小以及激
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