蒙古柳(Salix linearistipularis)耐鹽相關(guān)基因的挖掘研究.pdf

1、松嫩平原鹽堿土壤的pH值在9.2以上，通過(guò)對(duì)該地區(qū)自然生長(zhǎng)的植物資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)分布著約51科184屬的鹽生植物，多數(shù)以草本植物為主，蒙古柳（Salixlinearistipularis）是松嫩平原鹽堿地群落分布的唯一的木本植物，具有較強(qiáng)的耐鹽堿性，是松嫩平原鹽堿地重要的植物資源。
　　本文以蒙古柳為實(shí)驗(yàn)材料分析了鹽脅迫條件下蒙古柳響應(yīng)逆境的生理特性。利用FOX hunting system技術(shù)將蒙古柳cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入酵母菌和擬南芥

2、，以高NaCl脅迫篩選抗性酵母克隆，建立擬南芥轉(zhuǎn)基因獨(dú)立株系。另外以NaCl作為脅迫因素對(duì)處理和未處理的兩組蒙古柳植株進(jìn)行RNA-Seq分析，并對(duì)蒙古柳的轉(zhuǎn)錄組與擬南芥轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較研究。
　　本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.蒙古柳資源:在各種非生物脅迫條件下(NaCl、Sorbitol、NaHCO3、H2O2和pH值)對(duì)蒙古柳進(jìn)行了種子萌發(fā)和根長(zhǎng)的分析，結(jié)果表明蒙古柳能夠在較高水平脅迫條件下生長(zhǎng)，體內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含

3、量在脅迫條件下有增加的趨勢(shì)，蒙古柳是一個(gè)抗逆性較強(qiáng)的鹽堿地木本植物。
　　2.酵母水平篩選:通過(guò)對(duì)酵母文庫(kù)的篩選獲得抗鹽克隆15個(gè)，序列分析表明大部分和毛果楊基因有高的相似性，其中包括金屬硫蛋白(MT2)、酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)基因，已有研究表明這些基因和鹽脅迫相關(guān)。
　　3.轉(zhuǎn)基因擬南芥獨(dú)立株系的建立:將蒙古柳cDNA農(nóng)桿菌文庫(kù)轉(zhuǎn)入擬南芥，建立轉(zhuǎn)基因擬南芥獨(dú)立株系9000多個(gè)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，鑒

4、定產(chǎn)生生物學(xué)性狀變化（主要分為葉片大小、株高、分枝數(shù)量、植株倒伏、抽薹時(shí)期，果莢長(zhǎng)、葉片數(shù)和葉形態(tài)變化）的株系28個(gè)。用加入130mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基經(jīng)初步篩選獲得耐鹽株系58個(gè)。通過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)，一個(gè)與毛果楊COP9復(fù)合體家族蛋白同源性比較高，一個(gè)與小麥的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶SAPK7有高的同源性，這些基因和高滲、鹽、氧化等非生物脅迫有關(guān)。
　　4.SlMT2功能驗(yàn)證:對(duì)在酵母文庫(kù)中篩選的蒙古柳金屬硫蛋白(SlMT

5、2)基因的轉(zhuǎn)基因植株（6個(gè)株系）解析結(jié)果表明，SlMT2轉(zhuǎn)基因擬南芥在NaCl、NaHCO3、H2O2、CuCl2、ZnCl2、CdCl2和Sorbitol等脅迫培養(yǎng)基中表現(xiàn)出比對(duì)照強(qiáng)的抗性，其中在CdCl2培養(yǎng)基中比野生型植株表現(xiàn)出強(qiáng)的抗性。
　　5.蒙古柳轉(zhuǎn)錄組分析:在鹽脅迫下通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)包括1397個(gè)上調(diào)和1637個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)功能富集分析發(fā)現(xiàn)2199個(gè)基因在50個(gè)GO術(shù)語(yǔ)和1103個(gè)基因在116個(gè)KEGG通路中顯著

6、富集。本研究把蒙古柳基因按照差異程度分成三類:差異表達(dá)量在4倍以上和1.5-4倍，將這兩個(gè)定義為有差異表達(dá)基因;差異表達(dá)量在0-1.5倍的基因，定義為沒(méi)有差異表達(dá)基因，把3個(gè)集合的基因富集到的通路分別與擬南芥耐鹽相關(guān)的差異表達(dá)基因注釋到的通路進(jìn)行整合，其中擬南芥鹽脅迫差異表達(dá)基因富集的通路分別與蒙古柳差異表達(dá)量在＞4倍的基因富集的通路有1個(gè)交集，在1.5-4倍的通路的交集有10個(gè)（這樣差異表達(dá)量≥1.5倍的基因和擬南芥差異表達(dá)基因富集的