血液循環(huán)中與急性心肌梗死相關(guān)聯(lián)miRNA的探索.pdf

1、目的：
　　心血管疾病因其逐年增長的發(fā)病率和死亡率，一直以來受到各界廣泛關(guān)注。盡管目前已有廣泛可用的診斷治療途徑，心血管疾病的流行、死亡率和治療花費在發(fā)達國家及發(fā)展中國家仍呈上升趨勢。急性心肌梗死（acute myocardialinfarction，AMI）是世界范圍內(nèi)最常見的心血管疾病之一，為有效控制AMI的發(fā)生和發(fā)展，尋求新的診斷和治療的指標(biāo)和方法十分必要。
　　近年以來，研究表明miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展中可通過靶向調(diào)

2、節(jié)其下游靶基因發(fā)揮作用。在多個研究領(lǐng)域都得到廣泛重視，包括腫瘤、心血管疾病等等。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在急性心肌梗死患者血液和血漿中發(fā)生改變，如miR-1、miR-133a，miR-208b，miR-499，和miR-328，提示循環(huán)miRNA在AMI早期診斷中具有價值。
　　本實驗的目的是篩選AMI發(fā)生時血液循環(huán)中異常表達的miRNA;分析異常表達miRNA表達水平變化，并判斷其作為輔助診斷的價值;初步探索AMI發(fā)生時異常表達mi

3、RNA發(fā)揮調(diào)控作用的可能途徑。
　　第一部分 急性心肌梗死發(fā)生時血液循環(huán)中異常表達miRNA篩選和鑒定
　　方法：
　　1.收集30例AMI患者和30例健康成人志愿者的血漿樣本。
　　2.采用Agilent miRNA芯片分別檢測隨機選取3例AMI患者和3例健康成年志愿者血漿中miRNA的表達情況，篩選有顯著差異表達的miRNA。
　　3.應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測30例AMI患者和30例健康成人志愿者的

4、血漿樣本中miRNA芯片篩選出的有差異表達的miRNA的表達情況，對miRNA芯片的結(jié)果進行驗證。
　　4.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗標(biāo)準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.通過miRNA芯片檢測出共有36種miRNA在AMI患者血漿中出現(xiàn)異常表達，其中有23種miRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，13種miRNA表達水平明顯下降（P＜0.05）。
　　2.qRT-PCR驗

5、證的結(jié)果表明30例AMI患者血漿中除miR-361-5p，miR-182-5p，miR-497-5p，miR-20a-5p四種miRNA表達水平與正常對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），其余32種miRNA表達水平較正常對照組相比出現(xiàn)顯著性變化(P＜0.05)，其中上調(diào)的miRNA有20種，下調(diào)的miRNA有12種。
　　第二部分 AMI發(fā)生時血液循環(huán)中miR-486，miR-150和miR-26a表達變化分析及作為輔助診斷的

6、價值
　　方法：
　　1.收集110例AMI和110例健康成人志愿者的血漿樣本，110例AMI患者中分別有45例NSTEMI患者和65例STEMI患者，采集入院之后發(fā)病4h以內(nèi)，24h，48h，72h的血漿樣本。
　　2.qRT-PCR法檢測miR-486，miR-150和miR-26a在AMI各類型各時間段血漿樣本中的表達水平。
　　3.應(yīng)用受試者工作特性曲線(ROC)反映靈敏度與特異度，應(yīng)用ROC曲線下面積(

7、AUCROC)比較miR-486，miR-150和miR-26a對AMI的輔助診斷價值。
　　4.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0處理所有數(shù)據(jù)，檢驗標(biāo)準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.AMI發(fā)作4h以內(nèi)，miR-486和miR-150表達量分別為9.655±1.427和7.420±0.911，與正常對照組相比表達水平均顯著上調(diào)(P＜0.05); miR-26a表達量為0.092±0.104，與正常對照組相比表達水平顯

8、著下調(diào)(P＜0.05)。
　　2.AMI發(fā)作4h以內(nèi)，24h，48h，72h，miR-486和miR-150表達水平均隨時間延長逐漸降低，至72h時與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05);miR-26a表達水平隨時間延長逐漸升高，至72h時與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.AMI發(fā)作4h以內(nèi)，miR-486，miR-150和miR-26a的AUC曲線下面積分別為0.731(P＜0.05)，0.678(P＜

9、0.05)，0.763(P＜0.05)，表明這三種miRNA的表達水平檢測對檢測AMI的發(fā)生有一定的價值。這三種miRNA聯(lián)合檢測的AUC曲線下面積為0.792(P＜0.05)，表明具有更高的診斷價值。
　　4.AMI發(fā)作4h以內(nèi)，miR-486，miR-150和miR-26a表達在AMI的兩種類型STEMI和NSTEMI中存在顯著性差異。miR-486，miR-150和miR-26a在STEMI中的AUC曲線下面積分別為0.69

10、5(P＜0.05)，0.639(P＜0.05)，0.750(P＜0.05)，表明這三種miRNA的表達水平檢測對檢測STEMI的發(fā)生有一定的價值;miR-486，miR-150和miR-26a在NSTEMI中的AUC曲線下面積分別為0.782(P＜0.05)，0.734(P＜0.05)，0.782(P＜0.05)，表明這三種miRNA的表達水平檢測對檢測NSTEMI的發(fā)生有一定的價值;在STEMI和NSTEMI時這三種miRNA聯(lián)合檢測

11、的AUC曲線下面積分別為0.765(P＜0.05)，0.833（P＜0.05），說明三者聯(lián)合檢測具有更高的靈敏度和特異度，且在NSTEMI時具有更高的診斷價值。
　　第三部分 miR-486，miR-150在AMI發(fā)生時的作用機制的初步探索
　　方法：
　　1.通過TargetScan和miRanda尋找可能與miR-486，miR-150相關(guān)的靶基因
　　2.用Overlap PCR的方法擴增突變型CDKN1B

12、3'UTR和ALDH23'UTR片段，用普通PCR來擴增野生型CDKN1B3'UTR和ALDH23'UTR片段，將擴增出來的片段與pmirGLO雙粘載體進行重組，從而分別構(gòu)建野生型和突變型CDKN1B3'UTR和ALDH23'UTR的重組雙熒光素酶報告載體。
　　3.將野生型和突變型CDKN1B3'UTR重組報告載體分別與miR-150 mimics或者miR-150 scramble共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中;將野生型和突變

13、型ALDH23'UTR重組報告載體分別與miR-486 mimics或者miR-486 scramble共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。通過雙熒光素酶報告實驗驗證CDKN1B是否為miR-150的靶基因，ALDH2是否為miR-486的靶基因。
　　4.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0處理所有數(shù)據(jù)，檢驗標(biāo)準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)基因CDKN1B的3'UTR區(qū)可能是miR-150的一個下游直

14、接作用靶點，ALDH2的3'UTR區(qū)可能是miR-486的一個下游直接作用靶點。
　　2.經(jīng)酶切驗證，PCR驗證和測序結(jié)果驗證，成功構(gòu)建了野生型和突變型CDKN1B3'UTR和ALDH23'UTR的重組雙熒光素酶報告載體。
　　3.雙熒光素報告酶實驗顯示，miR-150 mimics和WT-pmirGLO-CDKN1B共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性為0.54±0.065，顯著低于其他三個共轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，表明CDKN1B是mi

15、R-150作用的靶基因;miR-486 mimics和WT-pmirGLO-ALDH2共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性為0.62±0.045，顯著低于其他三個共轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），表明ALDH2是miR-486作用的靶基因。
　　結(jié)論：
　　1.急性心肌梗死患者循環(huán)血液中，存在32種miRNA出現(xiàn)表達異常，20種miRNA表達明顯上調(diào)，12種miRNA表達明顯下調(diào)。
　　2.急性心肌梗死發(fā)作4h以內(nèi)，miR-486和miR-1