昆蟲Piwi蛋白及microRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與進(jìn)化分析.pdf

1、Piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一個(gè)亞家族，它通過與一類跟精子發(fā)生有關(guān)的小RNA的相互作用來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。Piwi蛋白參與干細(xì)胞的自我調(diào)控及精子的發(fā)生。對(duì)Piwi蛋白的研究有利于我們闡明該蛋白的生物學(xué)功能，也能促進(jìn)對(duì)piRNA(Piwi-interacting RNA)的了解。我們利用生物信息學(xué)同源搜索的方法在昆蟲基因組中搜索piwi的同源基因。利用EST延伸技術(shù)以及最新版本的GENSCAN軟件預(yù)測(cè)基因的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步拼接出基

2、因的全長(zhǎng)或部分cDNA序列。通過比較基因結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中的Piwi蛋白的外顯子數(shù)目之間存在差異，哺乳動(dòng)物的piwi基因含有20個(gè)外顯子，而昆蟲只有6-9個(gè)。我們推測(cè)Piwi蛋白在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了內(nèi)含子丟失或獲得的事件。在所有預(yù)測(cè)的Piwi-1ike蛋白中都發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)特征性的結(jié)構(gòu)域：PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域。使用MEME軟件預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)果獲得了6個(gè)保守的基序(Motif)，這些基序中包含了一個(gè)三聯(lián)體的催化位點(diǎn)“A

3、sp-Asp-His/Lys”，這個(gè)催化位點(diǎn)是Piwi蛋白行使剪切活性時(shí)所必需的。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步驗(yàn)證了家蠶中siwi1和siwi2蛋白的表達(dá)。最后，對(duì)Piwi蛋白家族做了系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹結(jié)果顯示無(wú)脊椎動(dòng)物中的Piwi同源蛋白可以分為三個(gè)枝，其中昆蟲的Ago3蛋白與哺乳動(dòng)物Piwi蛋白位于相鄰進(jìn)化枝上。 剛剛測(cè)序結(jié)束的11種果蠅的基因組為我們進(jìn)一步分析Piwi蛋白以及比較相近物種之間的進(jìn)化關(guān)系提供了很好的材料。

4、果蠅Piwi蛋白家族可分為三類：piwi、Aub以及Ago3。它們因參與一類跟精子發(fā)生有關(guān)的小RNA的通路而引起廣泛的關(guān)注。我們?cè)谥把芯抗ぷ鞯幕A(chǔ)上進(jìn)一步分析了11種果蠅基因組中的Piwi蛋白，結(jié)果獲得了33個(gè)piwi的同源基因，并且發(fā)現(xiàn)果蠅的piwi和Aub基因在基因組上相距20kb以內(nèi)。利用最新版本的GENSCAN軟件預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果獲得了22個(gè)全長(zhǎng)的cDNA序列，而在我們之前的工作中只拼接出6個(gè)完整的ORF。這22個(gè)全長(zhǎng)的基因

5、主要集中在piwi和Aub基因，而Ago3基因因含有較長(zhǎng)的內(nèi)含子導(dǎo)致很難拼接出全長(zhǎng)序列?；蚪Y(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，piwi(1284bp)和Aub(840bp)基因的第一個(gè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度明顯大于剩余的其它內(nèi)含子的長(zhǎng)度(piwi平均為93bp和Aub平均為54bp)。而這種現(xiàn)象在哺乳動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)。另外發(fā)現(xiàn)Ago3基因的內(nèi)含子和外顯子中分布著大量的重復(fù)序列。其中有四個(gè)果蠅的第三個(gè)內(nèi)含子中由于長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的插入而顯示出很強(qiáng)的保守性。進(jìn)化分

6、析的結(jié)果跟之前研究工作的結(jié)論一致，昆蟲的Ago3基因與哺乳動(dòng)物的piwi基因在進(jìn)化樹上位于相鄰的進(jìn)化枝中。 MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22m的內(nèi)源性的非編碼小RNA，它通過與Argonaute蛋白家族中的AGO亞家族結(jié)合去調(diào)控基因的表達(dá)，降解mRNA或抑制翻譯。從家蠶的卵、幼蟲、蛹和成蟲四個(gè)齡期提取總的RNA并利用sequence-by-synthesis(SBS)的方法進(jìn)行測(cè)序。本文利用生物信息學(xué)的方法和計(jì)

7、算機(jī)編程的技術(shù)從家蠶的SBS數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)microRNA基因。從家蠶四個(gè)時(shí)期樣本中總計(jì)測(cè)序得到了2，227，930個(gè)序列，其中1，144，485分布于17到25nt范圍內(nèi)，得到相應(yīng)的256，604單一序列。有95，184序列完全匹配到家蠶的基因組中。利用生物信息學(xué)流程以及RNAfold軟件和TripletSVM算法，我們初步得到了3,750個(gè)可能的microRNA。利用microRNA芯片，我們驗(yàn)證有354個(gè)mieroRNA是真實(shí)存在。基

8、因組定位分析發(fā)現(xiàn)，Scaffold001808上連續(xù)分布了19個(gè)成簇分布的microRNA，EST表達(dá)分析暗示著這些microRNA是表達(dá)的。家蠶不同發(fā)育階段的microRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)有106個(gè)microRNA在家蠶發(fā)育中廣泛表達(dá)，248個(gè)microRNA是在卵和蛹高表達(dá)的，這暗示microRNA在昆蟲的胚胎和變態(tài)發(fā)育中起著重要作用。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。此外我們對(duì)人、小鼠、線蟲和已經(jīng)公布基因組