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1、依賴于5’-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶,被稱為“細(xì)胞能量代謝的主要調(diào)節(jié)器”。細(xì)胞能量代謝失衡,會(huì)引起代謝綜合征等多種疾病,嚴(yán)重影響人類的健康。作為能量代謝過程中重要的調(diào)節(jié)酶,AMPK可以作為代謝綜合征的治療靶點(diǎn)。
迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了AMPK的一些小分子激動(dòng)劑,如metformin、AICAR、噻唑類化合物等,其中,metformin和噻唑類化合物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療。然而,現(xiàn)有的藥
2、物存在著特異性差,用量大等缺點(diǎn)。尋找高效、低毒和特異性強(qiáng)的AMPK小分子激動(dòng)劑,已成為新型代謝綜合征治療藥物的重要研究方向。
本論文首先通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了Gambogic Acid對(duì)AMPK的激活作用。結(jié)合蛋白質(zhì)異源表達(dá)和體外相互作用實(shí)驗(yàn),表明Gambogic Acid與AMPK具有較強(qiáng)的相互作用。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)截短實(shí)驗(yàn),確證Gambogic Acid可能與AMPK-α亞基的催化區(qū)域結(jié)合。
本論文構(gòu)建了
3、AMPK-α蛋白、AMPK-α392蛋白、AMPK-α312蛋白、AMPK-α200蛋白以及AMPK-γ蛋白的原核表達(dá)體系,并通過對(duì)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等表達(dá)條件的摸索,確立了異源表達(dá)可溶性AMPK-α蛋白、截短蛋白以及AMPK-γ蛋白的表達(dá)條件:表達(dá)載體為pET32a(+),BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng),選擇LB或TB培養(yǎng)基,0.1mmol/L IPTG、16℃,165 r/min誘導(dǎo)20h,并通過親和柱層析的方法獲得可溶性的A
4、MPK-α蛋白、AMPK-α392蛋白、AMPK-α312蛋白、AMPK-α200蛋白和AMPK-y蛋白。
采用熒光滴定和ForteBio Octet Red系統(tǒng),對(duì)AMPK蛋白、AMPK-y蛋白、AMPK-α蛋白與Gambogic Acid的體外相互作用進(jìn)行研究,結(jié)果表明GambogicAcid與AMPK-α亞基具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。進(jìn)一步通過不同長(zhǎng)度的AMPK-α亞基與Gambogic Acid結(jié)合常數(shù)的比較,推斷Gam
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