以Matrigel作為神經(jīng)干細(xì)胞移植支架治療急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討 Matrigel作為急性脊髓損傷后細(xì)胞移植支架材料的可行性。
　　主要方法：
　　1.取新生24 h的SD大鼠大腦海馬組織，在體外用無(wú)血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液[成分為DMEM/ F12(1∶1)、20 ng/ ml EGF、20 ng/ ml bFGF、1% PS]進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。加入胎牛血清使其自然分化，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。體外分別采用Matrigel、可吸收明膠海綿（abso

2、rbale sponge）、TCP/POC作為支架材料培養(yǎng)感染Ad-G FP腺病毒的NSCs，于培養(yǎng)后2 h、1 d、3 d、7 d、14 d在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在不同支架材料中的存活情況。將Matrigel/ NSCs混合物接種至裸鼠皮下成瘤，對(duì)瘤體進(jìn)行組織學(xué)分析觀察移植的NSCs在M atrigel中的生長(zhǎng)和分化情況。
　　2.制備SD大鼠脊髓的Allen’s打擊損傷模型。將動(dòng)物分為三組：PBS對(duì)照組（A組，于損傷位點(diǎn)注射P

3、BS），單純Matrigel組（B組，于損傷位點(diǎn)單純注射Matrigel），Matrigel/NSCs組（C組，于損傷位點(diǎn)植入Matrigel與NSCs的復(fù)合物）。暴露T10節(jié)段脊髓后予10×2.5g·cm的能量打擊。各組在SCI后7 d進(jìn)行移植處理，C組將Matrigel與用PKH67綠色熒光染料標(biāo)記的第三代NSCs（細(xì)胞密度為5×107/ml）在體外混勻后植入大鼠SCI后7 d的脊髓損傷位點(diǎn)，分別于移植后1d,7d,14d,28d在

4、激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察脊髓損傷部位移植NSCs的存活情況。術(shù)后通過(guò)BBB評(píng)分評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，觀察8周；移植處理后4，8周取損傷段脊髓行HE染色和免疫組織學(xué)檢測(cè)，觀察和評(píng)估Matrigel對(duì)損傷脊髓以及移植細(xì)胞的作用。
　　結(jié)果：
　　1.新生鼠海馬組織中分離出的 NSCs具有較強(qiáng)的克隆能力，可形成細(xì)胞團(tuán)，呈不規(guī)則球形，免疫熒光結(jié)果提示早期形成的神經(jīng)球Nestin抗原呈陽(yáng)性；加入血清促使其分化2周，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提

5、示分化后的細(xì)胞GFAP抗原、MAP2抗原呈陽(yáng)性。
　　2.與 absorbale sponge和 TCP/POC兩種支架材料相比較，NSCs在Matrigel中的存活率以及存活時(shí)間優(yōu)于另外兩組，NSCs可在Matrigel中存活較長(zhǎng)時(shí)間；免疫熒光結(jié)果提示 NSCs可在 Matrigel中分化為β-tubulin3陽(yáng)性的神經(jīng)元；裸鼠皮下成瘤瘤體病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示Matrigel中神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并可見(jiàn)少許新生血管；組織免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)

6、果提示移植的細(xì)胞可分化為β-tubulin3和MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元。
　　3. PKH67示蹤 NSCs結(jié)果示NSCs在脊髓損傷部位可存活較長(zhǎng)時(shí)間。
　　4. C組各時(shí)相點(diǎn)BBB評(píng)分最高，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A組與B組各時(shí)相點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。植入處理4周時(shí)，脊髓組織HE染色結(jié)果顯示A組損傷部位神經(jīng)組織液化壞死形成體積不等的空洞；B組損傷部位空洞被植入的Matrigel填補(bǔ)，Matri

7、gel中可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)；C組損傷部位空洞被植入的Matrigel填補(bǔ)，可見(jiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞在植入的 Matrigel中生長(zhǎng)，且有少許血管生成。免疫組織學(xué)結(jié)果顯示：A組損傷部位無(wú)neun、NF-200、MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元，損傷部位邊緣可見(jiàn)較多Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞和GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，損傷中心則無(wú)Nestin表達(dá)；在B、C組損傷部位可見(jiàn)Nestin、neun、NF-200、MAP2、GFAP陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞，C組表達(dá)多于B組。植入