HBZ蛋白通過抑制C-EBPα信號通路促進白血病細胞生長的機制研究.pdf

1、人類T淋巴細胞白血病1型病毒(HTLV-1)是成人T細胞白血病(ATL)的致病病原。其中由HTLV-1病毒反義鏈編碼的HBZ蛋白在ATL發(fā)病過程中扮演著關(guān)鍵角色。HBZ蛋白通過調(diào)控多條腫瘤相關(guān)信號傳導途徑，從而導致T細胞淋巴瘤的發(fā)生。研究顯示，HBZ具有促進腫瘤細胞生長的作用，但具體機制不詳。C/EBPα蛋白介導的信號通路在細胞生長、分化、腫瘤形成以及宿主免疫反應等方面發(fā)揮重要作用。C/EBPα蛋白作為腫瘤抑制因子具有抑制細胞生長的作用

2、。前期研究發(fā)現(xiàn)HBZ可抵消C/EBPα對T細胞生長的抑制作用。和HBZ蛋白一樣，C/EBPα同樣含有bZIP結(jié)構(gòu)域。已有的報道顯示，HBZ可與bZIP蛋白相互結(jié)合參與調(diào)節(jié)多條細胞信號傳導途徑，從而影響機體內(nèi)的各種生物學過程。這提示HBZ可能通過調(diào)控C/EBPα蛋白從而抑制C/EBPα信號傳導。
　　為了揭示HBZ蛋白促進腫瘤細胞生長的分子機理，本研究從細胞和分子水平研究HBZ蛋白對C/EBPα信號通路的調(diào)控作用，進而揭示HBZ促進

3、腫瘤細胞生長的分子機制。主要內(nèi)容如下:
　　第一部分: C/EBPα在ATL中異常高表達
　　首先，運用real-time PCR檢測到與陰性對照Jurkat細胞相比，6種HTLV-1感染細胞株MT-4、MT-1、TL-Om1、43T-、ED、ATL-2中CEBPA mRNA的表達水平明顯較高。利用Western blot技術(shù)進一步證實了C/EBPα蛋白在ATL細胞株43T-和MT-4中高表達。同時運用real-time P

4、CR檢測了3例正常人和6例ATL臨床病人樣品中CEBPA mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，與正常人相比C/EBPα在ATL患者中異常高表達。
　　第二部分:HBZ通過激活CEBPA基因啟動子從而促進C/EBPα表達
　　為了研究C/EBPα在 ATL中異常高表達的分子機制，首先采用real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)CEBPA mRNA在穩(wěn)定表達HBZ的Kit225細胞株中明顯高表達。同時運用real-timePCR檢測到在HB

5、Z轉(zhuǎn)基因鼠CD4+細胞中CEBPA基因同樣高表達。隨后，為了進一步研究HBZ上調(diào)C/EBPα的分子機制，我們克隆了CEBPA基因的啟動子核心區(qū)。運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)過表達HBZ可激活CEBPA基因啟動子的活性。而且染色質(zhì)免疫共沉淀實驗顯示HBZ可直接結(jié)合到CEBPA基因啟動子區(qū)域上。以上結(jié)果表明HBZ通過激活CEBPA基因啟動子從而促進C/EBPα表達。
　　第三部分:HBZ通過與C/EBPα結(jié)合從而抑制C/EBPα信

6、號通路
　　為了研究HBZ對C/EBPα信號通路的調(diào)控功能，首先運用雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，在Jurkat細胞中過表達HBZ可明顯抑制C/EBPα信號通路，且該抑制作用呈劑量依賴性。同時為了進一步研究HBZ抑制C/EBPα信號通路的分子機制，通過免疫沉淀實驗證實，HBZ可以與C/EBPα蛋白結(jié)合。最后，運用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)HBZ抑制了C/EBPα蛋白的DNA結(jié)合能力。因此，HBZ可通過結(jié)合C/EBPα蛋白從而抑制C/E

7、BPα信號通路。
　　第四部分:HBZ通過調(diào)控C/EBPα靶基因從而促進腫瘤細胞生長
　　為了進一步研究HBZ通過抑制C/EBPα通路促進細胞生長的分子機制，運用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在體外細胞水平上HBZ能顯著改變C/EBPα靶基因中與腫瘤細胞增殖相關(guān)基因的表達。其中HBZ上調(diào)了腫瘤標志基因E2F1、DHFR、PCNA和IL6的表達，下調(diào)了抑癌基因IL4、IFN-γ的表達。同時在HBZ轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實驗中，發(fā)現(xiàn)HBZ能夠上

8、調(diào)E2F1，PCNA和IL6的表達。以上結(jié)果提示，HBZ通過改變C/EBPα靶基因中細胞增殖相關(guān)基因的表達，從而促進腫痛細胞的惡性增生。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HTLV-1編碼的病毒蛋白HBZ通過與C/EBPα蛋白結(jié)合，阻遏其DNA結(jié)合能力，從而抑制C/EBPα信號傳導通路。首次闡明了HBZ通過對C/EBPα信號通路的負調(diào)控作用抵消了 C/EBPα對ATL細胞生長的抑制作用，從而影響了C/EBPα靶基因中細胞增殖相關(guān)基因的表達，