重編程過程中使用抗氧化劑降低人iPSCs基因組變異.pdf

1、背景:
　　人類胚胎干(ES)細胞具有在體外無限增殖和分化為多種細胞的潛能，可為再生醫(yī)學的替代療法提供充足的細胞來源。然而由于人ES細胞的分離涉及到倫理問題，從而限制了ES細胞的研究以及在再生醫(yī)學領域的潛在應用。2006年，日本京都大學山中伸彌(Shinya Yamanaka)團隊通過向小鼠皮膚成纖維細胞導入以逆病毒為載體的4個轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、 SOX2、c-Myc、Klf4，將成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞（Induce

2、d Pluripotent Stem Cells，iPSCs）。iPSCs和ES細胞功能類似，可以在體外無限增殖并具有多向分化能力。重編程技術(shù)繞開了ES細胞研究一直面臨的倫理障礙，在生物學基礎研究和臨床應用方面具有重大的潛在價值，因而成為了當前生物醫(yī)學研究的熱點。但是，多個小組的研究表明iPSCs的基因組存在變異，基因變異可能使移植的細胞在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，從而限制了iPSCs的應用。然而目前關(guān)于人iPSCs基因組變異的原因大部分未知。我們

3、的課題證明了人體細胞重編程過程中存在氧化應激，在誘導iPSCs產(chǎn)生過程中的培養(yǎng)基中添加抗氧化劑可以降低人iPSCs基因組的變異。我們的研究結(jié)果表明，可通過在誘導產(chǎn)生和維持iPSCs的培養(yǎng)基中添加抗氧化劑來提高人類iPSCs的質(zhì)量和安全性，從而為獲得更安全的iPSCs應用于再生醫(yī)學提供一定的參考價值。本研究分為兩個部分:1）人體細胞重編程誘導成iPSCs系統(tǒng)的建立;2）人體細胞重編程過程中加入抗氧化劑降低iPSCs基因組變異的研究。

4、>　　第一部分人體細胞重編程系統(tǒng)的建立
　　目的:建立人類成纖維細胞或者尿液細胞重編程為iPSCs的體系，為研究作用機制提供基礎。
　　方法:重編程四因子OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC以PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導入到目的細胞中進行誘導成iPSCs，挑選克隆后繼續(xù)培養(yǎng)，傳代和擴增，并對其進行鑒定如ES細胞特異標記分子的表達和體外細胞分化實驗明確獲得成熟的iPSCs。
　　結(jié)果:在人尿液來源的細胞和人的皮膚成纖維細

5、胞成功導入重編程四因子后均可觀察到明顯的細胞形變，經(jīng)檢測為ALP陽性。
　　結(jié)論:通過以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導入特定轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)典方法可以使人尿液來源的細胞和人的皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs。
　　第二部分體細胞重編程過程中使用抗氧化劑降低基因組變異
　　目的:人iPSCs的基因組存在變異阻礙iPSCs在生物及醫(yī)學領域的潛在應用。因此明確導致人iPSCs基因組變異的原因并發(fā)明方法以減少其變異，對于獲得安全的iPSCs用

6、于再生醫(yī)學非常重要。本研究旨在探究人體細胞重編程過程中氧化自由基應激是否是導致人iPSCs基因組變異的重要原因，加入抗氧化劑是否可以減少iPSCs基因組變異。
　　方法:在重編程過程中檢測ROS以及DNA損傷水平，并對比加入抗氧化劑后對ROS，DNA損傷和人iPSCs基因組變異的作用。
　　結(jié)果:相對于對照組，添加抗氧化劑可以顯著降低ROS和DNA損傷水平，加入抗氧化劑后獲得的iPSCs具有較少的基因組拷貝數(shù)變異。