EPCs示蹤膠質瘤及對其生長影響的MRI研究.pdf

1、背景:
　　內皮祖細胞(EPCs)起源于中胚層的成血管細胞，出生后主要存在于骨髓內。Asahara等在1997年從外周血中分離出了內皮祖細胞，目前被廣泛接受的是表達CD34+，CD133+和VEGFR-2+（也稱為KDR或FLK1）的細胞為內皮祖細胞。內皮祖細胞可以用貼壁培養(yǎng)、免疫磁珠篩選、流式細胞儀等方法從骨髓、臍帶血和外周血中分離出來，我課題組一直以來選用貼壁培養(yǎng)法分離大鼠脾臟起源的內皮祖細胞，并取得了較為滿意的效果。惡性膠質

2、瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，目前公認的治療方法是手術輔以化療和放療。但是由于GBM常侵犯周圍組織結構，膠質瘤干細胞對放化療耐藥性高，從而造成手術切除率低、術后復發(fā)率高，GBM的中位生存時間僅為14.6個月。近年來，隨著對惡性膠質瘤研究的進一步深入，某些細胞信號轉導途徑和相關基因在惡性膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中所起的作用越來越明確，這也讓新的治療方法，即生物靶向治療成為可能。近年來，很多學者設想使用某種載體攜帶細胞因子、自殺基因和溶瘤細胞基因治療膠

3、質瘤，作為生物靶向治療的載體，最基本的要求是其可以將治療基因特異性地帶入到腫瘤細胞內并使其充分表達。EPCs可以在多種細胞因子的趨化作用下從骨髓龕動員出來，歸巢至腦內膠質瘤，并分化成血管內皮細胞參與腫瘤新生血管的形成，這一特征使EPCs攜帶毒性基因、抗癌基因、化療藥物靶向治療膠質瘤成為可能。但EPCs歸巢后在膠質瘤內是如何分布的，是否會促進膠質瘤的生長或對其他生物學特性造成影響是EPCs作為膠質瘤靶向示蹤或治療載體需要解決的關鍵問題。我

4、們的前期研究結果顯示，劑量為1×106的EPCs注射入大鼠體內，CTP、MVD、腫瘤體積等指標證實EPCs不會促進膠質瘤的生長。但EPCs參與膠質瘤新生血管形成是一個復雜的過程，注入模型體內EPCs的數量、不同的觀察時間點、腫瘤生長周期以及所用MRI場強等都可能會對實驗結果造成一定程度的影響。為了進一步證實外源性EPCs對膠質瘤的生物學特性有無影響，本研究將較高劑量的EPCs注入膠質瘤大鼠體內，利用超高場強MRI觀察USPIO-EPCs

5、在大鼠膠質瘤內部分布的位點及遷移過程，進一步明確其示蹤膠質瘤的有效性，并通過DSC-EPI、腫瘤體積及病理學相關指標評價USPIO-EPCs對膠質瘤生長和相關生物學特性是否會造成影響。最終，為EPCs作為膠質瘤靶向示蹤、抗腫瘤基因或藥物的細胞載體研究提供實驗依據。
　　目的:
　　探討USPIO-EPCs在大鼠原位腦膠質瘤內的動態(tài)歸巢特點及可能的機制，分析EPCs對腫瘤生長和相關生物學特征變化的影響，為EPCs作為膠質瘤示蹤

6、、診斷和治療載體提供有效性、可行性和安全性的實驗依據。
　　材料和方法:
　　1.USPIO-EPCs示蹤大鼠原位腦膠質瘤及在膠質瘤內的動態(tài)歸巢超高場MRI研究
　　1.1.EPCs的分離、鑒定和培養(yǎng)
　　采用我科方靖琴等的方法。
　　1.2.建立原位C6膠質瘤模型和分組
　　將實驗大鼠分為腫瘤組、假腫瘤組和對照組，剪開大鼠頭皮，刺破顱骨和硬腦膜后，利用立體定向儀向腫瘤組和對照組注入10ulC6膠質瘤

7、細胞，而假腫瘤組僅注射入等量DPBS，建模后第7天腫瘤組和假腫瘤組經大鼠尾靜脈注入劑量為2×106的USPIO-EPCs，對照組僅注入等量的生理鹽水。
　　1.3.USPIO-EPCs示蹤膠質瘤MRI觀察
　　采用7.0T德國布魯克公同磁共振掃描儀Biospec70/20USR機型進行掃描，掃描序列包括T1WI、T2WI、T2map和SWI序列。分別在注射USPIO-EPCs前、注射1、3、5、7天后在每個序列上觀察腫瘤內部

8、信號變化情況。在T2map圖像上測量各組病變區(qū)在不同時間點的T2值，并繪制時間—T2map值曲線。
　　1.4.移植EPCs后膠質瘤的病理組織學特征觀察
　　在相同時間點對3組標本進行取材，用4％多聚甲醛和生理鹽水經左心室灌注，取出腦組織后進行石蠟包埋后進行病理學分析，用普魯士藍染色后觀察標本內是否有陽性的藍染顆粒及其分布的區(qū)域，對普魯士藍染色陽性的標本進行F4/80染色，觀察有無陽性表達，以鑒別藍染的細胞是吞噬鐵顆粒的巨噬

9、細胞還是USPIO-EPCs。對各標本進行MMP-9、VEGF、SDF-1染色等，觀察標本中陽性細胞的分布情況與普魯士藍染色陽性細胞的分布之間是否存在聯(lián)系。
　　2.USPIO-EPCs對大鼠原位腦膠質瘤生長特征影響的超高場動態(tài)MRI觀察
　　2.1.C6膠質瘤模型的建立和分組
　　在立體定向儀上建立大鼠膠質瘤模型后，將大鼠膠質瘤模型分為3個組，待腫瘤生長至第7天時，A組大鼠經尾靜脈注射入劑量為2×106的USPIO-

10、EPCs，B組大鼠注射劑量為3×106的USPIO-EPCs，對照組大鼠則只注射入等量的生理鹽水。
　　2.2.腫瘤體積的MRI形態(tài)學變化
　　3組均在移植EPCs1、3、5、7天后分別進行MRI掃描，在T1WI增強序列上測量腫瘤4個時間點的最大左右徑、前后徑、上下徑，根據公式左右徑×前后徑×上下徑計算出腫瘤的體積，通過統(tǒng)計學分析3組腫瘤在相同時間點的體積差異有無統(tǒng)計學意義。
　　2.3.腫瘤的灌注特征分析
　　

11、在DSC-EPI上得到3組腫瘤4個時間點的灌注圖像，通過image J6.0后處理軟件測量腫瘤區(qū)域5個點相應的rCBV和MTT數值，取平均數后進行統(tǒng)計學分析，觀察3組腫瘤相同時間點的血流灌注值有無差異。
　　2.4.腫瘤的病理組織學特征變化
　　大鼠處死灌注取材后對腫瘤標本進行CDTM、MMP-9和VEGF染色，在高倍鏡下(×200)選擇5個視野對CD34+染色陽性的區(qū)域進行計數，之后取平均值得到MVD，計數微血管標準是每個

12、染色為棕黃色的細胞計數為一個血管。除此之外，在微血管密度較高的區(qū)域選用高倍視野(×200)下隨機測量5個血管的最大橫徑，取其平均值為微血管直徑。在高倍鏡下(×200)在MMP-9和VEGF陽性表達密集的區(qū)域進行計數，通過統(tǒng)計學分析3組的病理學指標在相同時間點的差異有無統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.USPIO-EPCs示蹤大鼠原位腦膠質瘤結果及動態(tài)歸巢特征
　　1.1.USPIO-EPCs示蹤腦膠質瘤的動態(tài)MRI表現(xiàn)

13、
　　假腫瘤組移植USPIO-EPCs前后在SWI上均表現(xiàn)為低信號，T2map—時間曲線趨于平直，而腫瘤組在移植USPIO-EPCs前顱內病變在SWI上呈等高信號，移植USPIO-EPCs1天后，腫瘤周邊出現(xiàn)少許點狀低信號，第3天后SWI上腫瘤內部出現(xiàn)點狀、蜿蜒狀低信號，主要沿血管分布。移植第5天和第7天后發(fā)現(xiàn)腫瘤內低信號隨瘤齡的增長逐漸增多，興趣區(qū)的T2map—時間曲線呈下降趨勢。對照組腫瘤體積逐漸增大，而其內信號沒有明顯改變。

14、
　　1.2.USPIO-EPCs示蹤腦膠質瘤的組織學特征
　　腫瘤組經普魯士藍染色后也發(fā)現(xiàn)了同MRI一致的現(xiàn)象，假腫瘤組經普魯士藍染色后在腦組織內僅發(fā)現(xiàn)零星分布的藍染細胞，對腫瘤組和假腫瘤組各時間點的普魯士藍染色陽性細胞進行計數，經統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)兩組在各個時間點的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。由于巨噬細胞吞噬鐵顆粒后在普魯士藍染色上也可呈陽性，我們將染色陽性的標本用F4/80染色后卻未發(fā)現(xiàn)陽性結果，證明藍染的細胞是

15、USPIO-EPCs，而非巨噬細胞。
　　1.3.USPIO-EPCs示蹤腦膠質瘤的免疫組化染色
　　腫瘤組在移植USPIO-EPCs1天后腫瘤外周區(qū)有明顯的SDF-1和MMP-9表達，而腫瘤中央區(qū)表達相對較少;7天后在腫瘤中央區(qū)及外周區(qū)均有較多的SDF-1和MMP-9染色陽性細胞分布，其分布基本與普魯士藍染色陽性的分布情況基本一致，而VEGF染色陽性細胞僅隨著瘤齡的增長逐漸增多，一直比較均勻地分布于腫瘤內部。
　　2

16、.磁標記的外源性EPCs對大鼠原位腦膠質瘤生長影響的動態(tài)MRI觀察
　　2.1.不司劑量USPIO-EPCs對膠質瘤生長的影響
　　移植USPIO-EPCs后第1、3、5、7天，3組腫瘤的體積在各個時間點的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.2.不同劑量USPIO-EPCs對膠質瘤MRI灌注的影響
　　DSC-EPI掃描后發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域較對側腦組織呈明顯的高灌注，各組的rCBV值隨著瘤齡的增長逐漸增加，組

17、間相同時間點的MTT和rCBV的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.3.不同劑量、不同時相USPIO-EPCs對膠質瘤病理學特征的影響
　　腫瘤經HE染色后在鏡下發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞呈梭形，增長活躍，排列雜亂無序，與正常腦組織可見—較明顯的邊界，但在交界區(qū)可見腫瘤細胞浸潤入腦組織中。VEGF主要表達于腫瘤細胞胞質和胞漿內，血管內皮細胞的胞質內也可見少量表達，MMP-9大多表達于腫瘤細胞胞漿和血管基底膜上，對3組各個時間點的

18、VEGF和MMP-9陽性表達細胞進行計數，發(fā)現(xiàn)VEGF和MMP-9的陽性表達數目在相同時間點的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。腫瘤組織經CD34+免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)染色陽性的微血管呈蜿蜒狀或環(huán)狀，形態(tài)各異大小不一，分布不均勻。我們通過對MVD計數表明，3組大鼠膠質瘤模型的相同時間點的MVD值差異并沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，3個組的MVD和rCBV值存在正相關。3組腫瘤生長到第14天的微血管直徑為17.25—24.38μm，統(tǒng)

19、計學分析發(fā)現(xiàn)微血管直徑在3組的差異也沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論：
　　1、USPIO標記的EPCs可以向大鼠膠質瘤區(qū)域歸巢，并可以被MRI所檢測，7.0 T超高場MRI清晰的顯示EPCs早期主要分布在膠質瘤外周區(qū)域，隨著瘤齡的增長逐漸遷移到腫瘤中心區(qū)域。腫瘤組織不同區(qū)域SDF-1和MMP-9表達變化與USPIO標記的EPCs在腫瘤內的分布變化有明顯的相關性，表明SDF-1和MMP-9在腫瘤內部表達分布變化情況

20、可能是促使外源性EPCs由腫瘤周邊向腫瘤中央區(qū)域遷移的分子生物學機制之一。
　　2、建立大鼠原位腦膠質瘤需刺破腦組織，創(chuàng)傷也可導致EPCs向病變區(qū)域歸巢。我們通過建立假腫瘤組，將歸巢的EPCs的數目與腫瘤組的進行對比，發(fā)現(xiàn)腫瘤組歸巢的EPCs數目明顯多于假腫瘤組，證明EPCs主要歸巢至腦膠質瘤。同時，用F4/80染色普魯士藍陽性細胞，并未發(fā)現(xiàn)明顯陽性表達，進一步證明實驗中普魯士藍染色陽性的是吞噬了鐵磁顆粒的內皮祖細胞而非巨噬細胞。