雙抗夾心ELISA檢測(cè)EV71試劑盒的研發(fā).pdf

1、手足口病是一種由腸道病毒引起的傳染病，感染該病的主要是嬰幼兒，感染該病的患者主要表現(xiàn)出低熱、手、足、口等部位出現(xiàn)皰疹，大部分患者一周左右可以自愈，少部分患者會(huì)引起并發(fā)癥，個(gè)別嚴(yán)重的患者甚至死亡，目前，還沒(méi)有針對(duì)該病的有效治療藥物。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒A16型（Cox A16）和EV71病毒（EV71）是最常見的兩種。而感染手足口病后癥狀較嚴(yán)重的大多是由 EV71病毒引起的，由于 EV71病毒引起的手足口病發(fā)病

2、急、傳染快、致死率高、致殘率高，我國(guó)衛(wèi)生部已將其列入丙類傳染病進(jìn)行防控治療。
　　EV71病毒屬于小 RNA病毒科腸道病毒屬，據(jù)目前報(bào)道該病毒存在3個(gè)亞型，亞型A、B和C。其中亞型B又可分為亞型B1～B5,亞型C分為亞型C1～C4，目前我國(guó)流行的 EV71病毒感染病例主要是由亞型 C4引起的。EV71病毒是目前腸病毒屬中發(fā)現(xiàn)最晚的病毒，它的感染性特別強(qiáng)而且致病率非常高， EV71病毒引起的手足口病容易造成患者心、腦、神經(jīng)系統(tǒng)等功能

3、的障礙，最終因治療無(wú)效引發(fā)患者病重身亡，EV71引起的手足口病對(duì)人類健康、尤其嬰兒健康造成巨大威脅，但目前仍無(wú)特效抗病毒藥物和商品化疫苗問(wèn)世，因此，EV71預(yù)防疫苗的研發(fā)，手足口病例的快速而有效的檢測(cè)，治療性抗體的制備等研究具有極其重的臨床意義和社會(huì)意義。
　　本實(shí)驗(yàn)我們以純化的 EV71全病毒作為抗原，免疫 BALB/c小鼠，利用細(xì)胞融合技術(shù)，使小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化

4、、結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)，最終篩選出分泌單克隆抗體的五株雜交瘤細(xì)胞。同時(shí)利用雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔，收集腹水獲得大量的特異性結(jié)合EV71全病毒的廣譜性鼠源單克隆抗體。
　　我們將篩選出的單克隆抗體4F12作為包被抗體，EV71疫苗作為抗原，2B6-HRP作為酶標(biāo)抗體建立雙抗體夾心ELISA法，我們通過(guò)對(duì)抗體包被量、抗原檢測(cè)范圍、酶標(biāo)抗體的稀釋濃度以及封閉液包被液等的優(yōu)化，最終確定了雙抗體夾心 ELISA的方法，其中抗體包被量為100ng