柯氏棒狀桿菌免疫刺激效應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的:
　　檢測(cè)柯氏棒狀桿菌(Corynebacterium kroppenstedtii，CK)對(duì)BMDC(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)的活化刺激作用，以及該BMDC對(duì)Th細(xì)胞亞群分化的調(diào)節(jié)，初步探討CK的免疫刺激效應(yīng)。
　　方法:
　　1.通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌的16S rDNA基因序列確認(rèn)CK標(biāo)準(zhǔn)菌株CCUG35717和產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌（Corynebacterium p

2、yruviciproducens，CP）標(biāo)準(zhǔn)菌株CCUG57046;
　　2.體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(Bone marrowderived-dendritic cell，BMDC)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11c+細(xì)胞的比例，確定BMDC的純度;
　　3.以CP為對(duì)照菌株，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDC經(jīng)CK刺激后其表面共刺激分子（CD40、CD80和CD86）和MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)水平;
　　4.BMDC經(jīng)CK

3、刺激后，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)炎性細(xì)胞因子mRNA（IL-12p35、IL-6、IL-23和TGF-β）表達(dá)水平的變化，并通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中相應(yīng)細(xì)胞因子（IL-12、IL-6、IL-23和TGF-β）蛋白水平的變化;
　　5.磁珠分選C57BL/6小鼠脾臟中的CD4+T細(xì)胞，將CK/CP處理過(guò)的BMDC與CD4+T細(xì)胞以一定的比例（BMDC∶CD4+T為1∶5）進(jìn)行共培養(yǎng)72 h后，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CD4+

4、T細(xì)胞中T-bet和ROR-γt的mRNA表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-17的濃度;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1和Th17細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:
　　1.將CK和CP的基因序列檢測(cè)結(jié)果與GenBank上16S rDNA的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，確認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)菌株;
　　2.成功誘導(dǎo)了BMDC，誘導(dǎo)得到的CD11c+細(xì)胞的比例大于80％;
　　3.CK能夠上調(diào)BMDC表面MHCⅡ類(lèi)分子和共刺激分子(C

5、D40、CD80和CD86)的表達(dá)，促進(jìn)BMDC的成熟;
　　4.與對(duì)照菌株CP相比，無(wú)論是mRNA的表達(dá)水平還是蛋白的表達(dá)水平，CK能夠有效地促進(jìn)BMDC產(chǎn)生和分泌IL-12(P＜0.05)、IL-6(P＜0.001)、IL-23(P＜0.001)和TGF-β(P＜0.01)等炎性細(xì)胞因子。
　　5.BMDC與CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)結(jié)果顯示，CK處理后的BMDC能夠上調(diào)CD4+T細(xì)胞中T-bet(P＜0.01)和ROR-γ

6、t(P＜0.001) mRNA的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞中IFN-γ(P＜0.001)和IL-17(P＜0.001)的分泌能力，且Th1和Th17細(xì)胞的比例也有所增高。
　　結(jié)論:
　　1.CK能夠活化BMDC并上調(diào)BMDC表面分子(MHCⅡ、CD40、CD80和CD86)的表達(dá)，從而促進(jìn)BMDC的成熟;
　　2.CK通過(guò)促進(jìn)BMDC分泌相應(yīng)的炎性細(xì)胞因子進(jìn)而激活CD4+T細(xì)胞;上調(diào)CD4+T細(xì)胞中T-bet和RO