飽和富氫液對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、富氫液對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一。大量研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子釋放以及細(xì)胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變中起重要作用。目前，對(duì)于糖尿病神經(jīng)病變尚無有效的防治措施!近年眾多研究表明，低濃度氫分子(<4％)及富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，并已證明可應(yīng)用于多種疾病動(dòng)物模型的治療，如：臟器的缺血/再灌注損傷、神經(jīng)退行病變、膿毒血癥等。因此，越來越多的學(xué)者認(rèn)為氫氣與富氫液

2、是一種新型的醫(yī)學(xué)氣體分子。本課題利用離體高糖培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞(RSC96)和在體糖尿病大鼠模型，探討富氫液對(duì)糖尿病神經(jīng)病變保護(hù)作用的可能機(jī)制，為臨床治療奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一、
　　富氫液對(duì)高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞損傷的影響
　　目的：高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及導(dǎo)致的雪旺細(xì)胞的凋亡在糖尿病神經(jīng)病變的病理生理過程中具有重要意義。富氫液具有選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)擬利用高糖培養(yǎng)下的雪旺細(xì)胞(RSC96)，探討富

3、氫液對(duì)于高糖培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞影響。
　　方法：
　　大鼠永生化雪旺細(xì)胞株(RSC96細(xì)胞)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于6孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3 mL/孔或200μL/孔，細(xì)胞密度2×l06/mL。
　　第一部分：不同濃度高糖誘導(dǎo)下對(duì)雪旺細(xì)胞的影響，體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞分為5組(n=30)：正常對(duì)照組(5.6mmol/L)和高糖組(25 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L)、甘露醇組，分別

4、于培養(yǎng)24h、48h、72h應(yīng)用MTT(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)法檢測(cè)高糖對(duì)RSC96細(xì)胞增殖的影響；同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子(IL-1β，HMGBl)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物(MDA、8-羥基脫氧鳥苷)變化情況。
　　第二部分：富氫培養(yǎng)液對(duì)高糖培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞影響。
　　1.體外培養(yǎng)的RSC96雪旺細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為6組(n=6)：正常對(duì)照(Con)組、高糖(HG)組(根據(jù)第一部

5、分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50mmol/L高糖組入選)、富氫水(HS)組、HG+HS(0.15/0.30/0.60mmol/L)組，細(xì)胞培養(yǎng)采用正常培養(yǎng)液與不同濃度的含氫培養(yǎng)液培養(yǎng)，給予或不給予高糖處理，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。
　　2.探討飽和富氫培養(yǎng)液對(duì)于高糖所致雪旺細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)分為三組(n=6)：正常對(duì)照(Con)組、高糖(HG)組、HG+HS(根據(jù)第二部分實(shí)驗(yàn)，0.60m

6、mol/L組入選)。對(duì)照組培養(yǎng)基含糖5.6mmol/L，HG組含糖50 mmol/L，HG+HS組為含有0.6mmol/L氫分子的高糖培養(yǎng)基。48h末，進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量；Elisa法測(cè)定炎癥因子IL-6、HMGBl的水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)表達(dá)水平。觀察含氫培養(yǎng)液對(duì)高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞的損傷(氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以

7、及細(xì)胞凋亡)的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.與Con組細(xì)胞相比，在24h、48h、72h末高糖處理組的氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、8-OHDG，細(xì)胞促炎癥因子的釋放均明顯增加，但在48h更為明顯；甘露醇組細(xì)胞無明顯變化；
　　2.MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比在24h、48h、72h末，高糖處理組成活細(xì)胞數(shù)量少、死亡率高，且在48h末最為明顯(P＜0.05)。
　　3.與對(duì)照組相比較，在高糖處

8、理組中50mmol/L組，氧化應(yīng)激產(chǎn)物生成、炎癥因子釋放、細(xì)胞死亡率升高更為明顯(P＜0.05)。
　　4. Con組與甘露醇組相比，上述指標(biāo)無明顯差異(P＞0.05)。氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子的釋放參與高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞的活力；各高糖處理組在48h時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，其中50mmol/L高糖培養(yǎng)基損傷最為嚴(yán)重。
　　第二部分：MTT法結(jié)果表明：給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理對(duì)于正常培養(yǎng)液雪旺細(xì)胞的增殖

9、活力無明顯影響(P＞0.05)；給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以顯著降低含高糖培養(yǎng)基對(duì)于雪旺細(xì)胞的損傷，且0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液作用效果明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與Con組相比，HG和HG+HS組SOD活性下降，炎癥因子釋放(IL-6與HMGBl)，MDA含量、細(xì)胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白以及凋亡的雪旺細(xì)胞數(shù)目表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)；與高糖組比較，HG+HS組細(xì)胞活力升高，SOD活性升高，MDA

10、含量減少，IL-6、HMGB-l水平、細(xì)胞凋亡數(shù)目以及細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷；降低促炎癥因子的釋放；下調(diào)Caspase-3活化片段蛋白的表達(dá)，減少高糖誘導(dǎo)下雪旺細(xì)胞的凋亡，其中0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液處理效果最為明顯。
　　實(shí)驗(yàn)二、
　　飽和富氫液對(duì)糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護(hù)作用
　　目的：飽和富氫液是一

11、種溶解氫氣至飽和狀態(tài)的生理鹽水，通過體外高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞離體模型的研究發(fā)現(xiàn)，富氫液具有抗氧化、抗炎、減少高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)以前期體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，利用糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，擬探討飽和富氫液對(duì)糖尿外周神經(jīng)病變治療效果。
　　方法：健康雄性SD大鼠，體重280-310g(中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。
　　第一部分：不同劑量的飽和富氫液對(duì)于糖

12、尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型的保護(hù)作用。40只大鼠隨機(jī)分為5組(n=6)，正常對(duì)照組(Con組)，糖尿病模型組(DM組)、飽和富氫液處理組(DM+HS5 ml，10ml，20ml/kg組)。建立糖尿病模型成功4周后，DM+HS組大鼠腹腔注射不同劑量飽和富氫液(5 ml，10ml，20ml/kg/day)連續(xù)治療4周，Con組與DM組大鼠腹腔給予生理鹽水注射持續(xù)4周，觀察各組大鼠神經(jīng)疼痛行為學(xué)在不同時(shí)間點(diǎn)(5thW、6thW、7thW、8thW

13、末)變化。檢測(cè)各組大鼠基礎(chǔ)情況下及第4、8周末，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)的變化；第8周末，檢測(cè)血糖水平及糖基化終末產(chǎn)物含量，坐骨神經(jīng)炎癥因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β及IL-10)水平、氧化應(yīng)激產(chǎn)物的含量(MDA、SOD)。
　　第二部分：飽和富氫液對(duì)于糖尿周圍神經(jīng)病變大鼠模型坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。18只大鼠隨機(jī)分為3組(n=6)，正常對(duì)照組(Con)組、糖尿病模型組(DM)、飽和富氫液處理組(DM+HS10ml)

14、。HS(10ml/kg/day)組給予飽和富氫液連續(xù)治療4周，Con組、DM組給予同等體積的生理鹽水，8周末，Western blot法檢測(cè)坐骨神經(jīng)細(xì)胞中活化的Caspase-3、Bax以及Bcl-2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分第8周末，與基礎(chǔ)值相比，Con組大鼠體質(zhì)量增加，糖基化終末產(chǎn)物、血糖水平、神經(jīng)痛閾、MNCV坐骨神經(jīng)炎癥因子水平與基礎(chǔ)值比較無明顯變化。與Con組大鼠相比，糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、糖基化終末

15、產(chǎn)物、血糖水平明顯升高、痛閾值明顯降低、炎癥因子釋放與氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量增加(P﹤0.05)；與DM組相比，飽和富氫液治療的各組大鼠體質(zhì)量和血糖水平無明顯改善(P＞0.05)，但大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度增加、熱痛閾和機(jī)械性痛閾提高(P﹤0.05)，坐骨神經(jīng)中氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量以及TNF-α、HMGB1、IL-1β水平降低，IL-10水平升高，且10ml/kg飽和富氫液治療組效果最為明顯(P﹤0.05)。
　　第二部分：與Con組相比，DM

16、組與HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)增加，與DM組相比較，HG+HS組大鼠坐骨神經(jīng)中活化的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P﹤0.05)。
　　結(jié)論：氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放以及細(xì)胞凋亡參與了糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展；飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三、
　　線粒體ATP敏感性鉀

17、通道參與富氫液對(duì)糖尿病外周神經(jīng)病變大鼠的保護(hù)作用
　　目的：飽和富氫液可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，有效的減輕糖尿周圍神經(jīng)病變損傷。線粒體ATP敏感性鉀通道(MitoKATP通道)是多種處理措施或藥物的作用靶點(diǎn)，該通道激活后可有效的減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)擬探討飽和富氫液對(duì)糖尿周圍神經(jīng)病變保護(hù)機(jī)制，是否與線粒體ATP敏感性鉀通道激活相關(guān)。
　　方法：腹腔注射鏈脲霉素(65 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，18只糖

18、尿病大鼠，隨機(jī)分為3組：分為糖尿病組(DM組)、富氫水治療組(HS組)、ATP敏感鉀通道阻滯劑組(5-HD組)。HS組、5-HD組大鼠造模成功4周后，給予腹腔注射飽和富氫液(10ml/kg/day)連續(xù)治療4周，DM組給予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg/day)。第8周末，檢測(cè)各組大鼠坐骨疼痛行為學(xué)變化、神經(jīng)傳導(dǎo)速度功能的變化；并檢測(cè)坐骨神經(jīng)炎性因子(HMGB1、TNF-α、IL-1β、及IL-10)、氧化應(yīng)激水平及坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡及

19、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)第8周末，各組糖尿病大鼠體質(zhì)量降低、血糖水平升高；與DM組、5-HD組相比，飽和富氫液治療組血清糖基化終末產(chǎn)物明顯降低，糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P﹤0.05)；
　　(2)第8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、熱痛閾和機(jī)械性痛閾降低(P﹤0.05)；糖尿病組與5-HD組相比無明顯變化(P＞0.05)。
　　(3)第

20、8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)HMGB1、 TNF-α、IL-1β表達(dá)水平升高，IL-10表達(dá)水平降低(P﹤0.05)。
　　(4)第8周末，與飽和富氫液治療組相比，糖尿病組、5-HD組大鼠坐骨神經(jīng)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加，Caspase-3蛋白表達(dá)增加(P﹤0.05)。
　　結(jié)論：飽和富氫液產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，發(fā)揮對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變產(chǎn)生保護(hù)作用，可能與ATP敏感性鉀通

21、道的激活相關(guān)。
　　小結(jié)
　　1．飽和富氫液可有效地減少高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞損傷，該保護(hù)作用與飽和富氫液調(diào)控炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激、抗凋亡相關(guān)；
　　2．飽和富氫液減輕大鼠糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制，與調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)；
　　3．飽和富氫液可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用，部分逆轉(zhuǎn)糖尿病引發(fā)外周神經(jīng)病變，該機(jī)制與線粒體ATP敏感性鉀通道的激活相關(guān)；治療過程中均未發(fā)現(xiàn)毒副作用，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。