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文檔簡介
1、腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysms,AAA)是一種慢性炎癥性疾病,其病理特征是主動脈壁的重塑,常常由于主動脈夾層動脈瘤破裂而導致病人死亡。AAA的形成是與多種因素有關,包括巨噬細胞的浸潤,炎性因子和蛋白酶的釋放,彈力纖維的斷裂,血管平滑肌細胞的凋亡,膠原蛋白降解等,其中巨噬細胞浸潤在AAA的發(fā)病機理中具有重要作用。研究已經報道,慢性炎癥狀態(tài)(包括動脈粥樣硬化、氧化應激、血管緊張素II和炎性細胞因子)激活單核
2、/巨噬細胞,被激活的巨噬細胞滲透到血管壁并釋放蛋白酶,降解細胞外基質成分,包括膠原蛋白和彈性蛋白;同時,浸潤進血管壁的巨噬細胞在血管中膜和外膜分泌炎性細胞因子,如:TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6,進一步加劇炎癥反應。
巨噬細胞浸潤至血管壁的過程需要肌動蛋白細胞骨架的重新組構。在巨噬細胞浸潤過程中產生一種膜突出結構:偽足小體(podosome)。目前已知,多種細胞結蛋白和信號蛋白以肌絲蛋白為核心包裹行成的束狀pod
3、osome參與細胞的局部黏附和遷移。束狀 podosome呈現為點狀的染色,壽命2-10 min左右,但在炎癥環(huán)境下,束狀podosome逐漸積聚變?yōu)榄h(huán)形podosome(稱為podosome rosette),這種結構可持續(xù)數小時,持續(xù)進行細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)消化并促使細胞遷移。此外,podosome還包含多個信號蛋白,其中RhoA是podosome形成的一個關鍵信號分子。但是,目前關于pod
4、osome形成及其與巨噬細胞遷移的關系仍不清楚。
Myo9b作為一種與肌絲蛋白相關的馬達蛋白,其分子中包含的RhoGAP蛋白結構域具有抑制Rho信號的作用,因而能夠調節(jié)巨噬細胞的極性和遷移。盡管Myo9b在破骨細胞中表達并調節(jié)podosome形成已有報道,但是Myo9b與動脈瘤發(fā)生發(fā)展之間的聯系尚未闡明。
人類Krüppel樣因子5(KLF5)屬于SP/KLF轉錄因子家族,其在羧基末端具有三個共同的C2H2型鋅指結構
5、。大量研究表明KLF5可以激活多種與心血管重塑相關的基因。已有報道,KLF5在大型未破裂的腦動脈瘤中高度表達,但是KLF5介導AAA形成的確切機制尚不清楚。在AAA形成過程中,KLF5與 podosome形成和巨噬細胞浸潤的關系仍然未知。因此,本研究利用CaPO4誘導的小鼠腹主動脈瘤模型和人AAA組織,探討Myo9b在KLF5介導的巨噬細胞podosome形成和巨噬細胞浸潤中的作用,旨在為闡明KLF5在動脈瘤中的作用機制提供實驗基礎。<
6、br> 第一部分 KLF5通過促進巨噬細胞的遷移參與腹主動脈瘤的形成
目的:探討KLF5對巨噬細胞遷移的影響及其在AAA形成中的作用。
方法:1通過實時定量PCR(qRT-PCR)和免疫組化檢測人AAA組織中KLF5的表達,免疫雙熒光共定位檢測KLF5在血管組織中巨噬細胞和VSMCs的表達。2構建CaPO4誘導的小鼠AAA模型,HE染色證實模型成功。qRT-PCR和免疫組化檢測小鼠AAA組織中KLF5的表達。免疫雙
7、熒光共定位檢測KLF5在小鼠AAA組織巨噬細胞和VSMCs中的表達。3雜交培育骨髓源單核細胞KLF5基因特異性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色檢查血管組織和彈力纖維的變化。5免疫雙熒光共定位KLF5和巨噬細胞。
結果:
1人AAA組織中KLF5表達升高
與人正常主動脈組織相比,人AAA組織中KLF5mRNA表達水平升高,免疫組化KLF5染色陽性細胞數增加。對巨噬細胞和平滑肌細胞標志物進行免疫熒
8、光染色的結果顯示,在人AAA組織中巨噬細胞明顯增多,并且平滑肌細胞和巨噬細胞中KLF5表達均明顯增多,說明KLF5表達水平升高可能在AAA形成中發(fā)揮作用。
2 CaPO4誘導的小鼠AAA中KLF5表達水平增加
在形態(tài)學檢查證實,用CaPO4誘導成功建立小鼠AAA模型的基礎上,檢查KLF5在實驗型AAA組織中的表達變化。qRT-PCR結果顯示,KLF5 mRNA表達水平隨著CaPO4誘導天數的增加而升高,在第7天和第1
9、4天分別升高了2.39倍和2.14倍。免疫熒光染色結果證實,KLF5在巨噬細胞和VSMCs中均有表達,這與在人AAA組織中的檢測結果相同。這些結果表明,KLF5參與人和小鼠AAA的形成。
3巨噬細胞特異性敲除KLF5能減緩CaPO4誘導的小鼠AAA形成
KLF5-flox小鼠和 LysM-cre小鼠雜交培育遺傳性敲除巨噬細胞中KLF5的小鼠(KLF5-/-),與野生型(WT)小鼠相比,KLF5-/-小鼠經CaPO4誘
10、導的腹主動脈膨脹率顯著降低。HE染色結果顯示,KLF5-/-小鼠的腹主動脈組織結構接近正常,彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。結果顯示KLF5-/-小鼠腹主動脈的彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。免疫熒光染色結果顯示,與WT組比較,在KLF5-/-小鼠的血管組織中,KLF5染色陽性巨噬細胞數量明顯減少。這些結果表明,KLF5通過促進巨噬細胞浸潤而參與AAA形成。
小結:
KLF5在人和CaPO4誘導的小鼠AAA組織中
11、表達升高。KLF5在血管平滑肌細胞和巨噬細胞中均進行表達。巨噬細胞特異性敲除KLF5能夠減少巨噬細胞的浸潤,抑制CaPO4誘導的小鼠AAA的形成。
第二部分 KLF5通過上調Myo9b表達促進巨噬細胞podosome的形成和遷移
目的:揭示 KLF5促進巨噬細胞遷移和浸潤的分子與細胞生物學機制。
方法:1體外細胞劃痕實驗觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細胞的遷移。2 Transwell小室實驗觀察WT和KL
12、F5-/-巨噬細胞的侵襲能力。3掃描電鏡觀察巨噬細胞跨膜遷移時細胞足突。4活細胞工作站觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細胞的徑向運動變化。5 mRNA表達譜芯片檢測WT和KLF5-/-巨噬細胞的基因表達差異。6 qRT-PCR檢測細胞運動相關基因的表達。7在巨噬細胞中過表達和敲低KLF5后檢查運動相關基因的表達變化。8報告基因檢測KLF5對Myo9b基因啟動子的轉錄活性。9 Oligo pull-down分析確定KLF5在Myo9b基因
13、啟動子上的結合位點。
結果:
1 KLF5-/-巨噬細胞的遷移功能受損
從KLF5-/-和WT小鼠分離培養(yǎng)骨髓源巨噬細胞,劃痕實驗結果表明, KLF5-/-巨噬細胞的遷移進入劃痕區(qū)域的細胞數量比 WT巨噬細胞顯著減少。Transwell小室實驗證實,與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞的侵襲能力受損。掃描電鏡觀察結果顯示,與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞具有更少、更短的突觸和偽足。細胞免疫雙
14、熒光染色結果顯示,跨越濾膜的KLF5-/-巨噬細胞幾乎不表達KLF5。進一步用動態(tài)細胞成像技術觀察發(fā)現,與WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬細胞的徑向遷移能力受損,遷移速率明顯降低。
2 KLF5通過直接與Myo9b啟動子結合而上調Myo9b表達
mRNA表達譜芯片檢測結果顯示,與 WT組比較,KLF5-/-小鼠的運動相關基因在CaPO4損傷的主動脈組織中表達顯著下降。Gene Ontology富集分析發(fā)現,差異表
15、達的基因主要集中于細胞 Myosin肌絲和 Myosin復合物等蛋白相關基因。qRT-PCR對芯片分析結果進行驗證,Myo9a、Myo9b和Macf1基因表達在KLF5-/-小鼠顯著下調。分別在Raw264.7中過表達或敲低 KLF5,PCR和 Western blotting結果均顯示,在基礎水平和TNF-α誘導情況下,在巨噬細胞中過表達或敲低KLF5均能夠顯著增加或降低Myo9a和Myo9b的mRNA和蛋白水平。報告基因和Oligo
16、 pull-down分析結果表明,KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點結合而激活Myo9b基因表達。
3 KLF5缺失導致Myo9b表達下調及podosome形成減少
免疫熒光染色結果顯示,Myo9b與 podosome共定位。PDBu促進WT巨噬細胞形成 podosome,但在 PDBu處理的 KLF5-/-巨噬細胞中podosome數量顯著減少。Podosome陽性細胞數在TNF-α誘導的WT巨噬細胞
17、中顯著升高,但無論TNF-α誘導與否,KLF5-/-巨噬細胞中的podosome陽性細胞數均較少。Myo9b與Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色結果進一步證實, Myo9b定位于巨噬細胞的 podosome中。Myo9a不與Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬細胞中過表達KLF5能夠恢復podosome的形成。體內研究結果同樣證實,podosome結構在人和小鼠AAA組織
18、中與體外細胞中的結構相似。
小結:
KLF5在巨噬細胞中缺失造成細胞遷移功能受損。在巨噬細胞中, Myo9b是KLF5的直接靶基因,KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點相互作用激活Myo9b基因轉錄,KLF5缺失通過導致Myo9b表達下調而減少podosome形成。
第三部分 Myo9b通過負性調節(jié)RhoA信號促進巨噬細胞podosome的形成、遷移和AAA進展
目的:探索KLF5及受
19、其調控的Myo9b調節(jié)巨噬細胞podosome形成的分子機制。
方法:1用si-RNA敲低巨噬細胞中內源性Myo9b的表達,細胞免疫熒光染色觀察podosome的形成是否發(fā)生變化。2 Transwell小室實驗觀察Myo9b敲低對巨噬細胞侵襲能力的影響。3在Myo9b的巨噬細胞中過表達KLF5后經免疫熒光染色觀察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬細胞后,GTPase pull-down和Western blot檢測
20、巨噬細胞中與GTP結合的RhoA、Cdc42和Rac1及其總蛋白水平。5在巨噬細胞中分別過表達或敲低KLF5,GTPase pull-down和Western blot檢測RhoA、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表達變化。6用上述方法檢查RhoA特異性抑制劑對巨噬細胞podosome形成和細胞遷移的影響。7免疫雙熒光染色和qRT-PCR檢測人AAA組織中Myo9b的表達和定位。
結果:
1 Myo9b敲低減少
21、TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移
用Myo9b特異性siRNA(si-Myo9b)和非特異性siRNA(si-NS)轉染巨噬細胞,細胞免疫熒光染色結果顯示,與轉染si-NS的細胞相比,在轉染 si-Myo9b的細胞中 PDBu誘導的 podosome形成顯著減少,而且Myo9b敲低后,podosome的形成不再受TNF-α的影響。Transwell結果顯示,Myo9b敲低后,穿越濾膜的巨噬細胞的數目顯著低于
22、轉染si-NS的細胞。反之,在巨噬細胞中過表達KLF5能夠促進podosome的形成,但是這種效應在轉染si-Myo9b的巨噬細胞中被取消。
2在巨噬細胞中KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP水平
GTPase pull-down和Western blot結果顯示,在TNF-α刺激的巨噬細胞中,與GTP結合的Cdc42、Rac1和RhoA水平顯著增加,其中RhoA-GTP水平在30min達到峰值,6 h恢復至基礎水
23、平。與此同時,伴隨著RhoA-GTP水平的下降,Myo9b的表達水平增加。在巨噬細胞中敲低或過表達KLF5后,經GTPase pull-down和Western blot檢查Myo9b表達及RhoA-GTP水平的變化。結果表明,過表達KLF5顯著上調Myo9b的表達,并且減少RhoA-GTP的水平;敲低KLF5顯著下調Myo9b的表達,增加RhoA-GTP的水平。免疫熒光結果顯示,與Rhosin處理的WT巨噬細胞相比,KLF5-/-巨噬
24、細胞經Rhosin處理后,PDBu誘導形成的podosome數目顯著增多。Transwell結果顯示,與未經處理的KLF5-/-巨噬細胞相比,Rhosin處理后細胞侵襲能力顯著增加。
3在人組織中Myo9b表達上調并且定位于巨噬細胞
免疫雙熒光染色結果顯示,人AAA組織中Myo9b的表達與正常組比較顯著升高,且主要定位于MAC2陽性的巨噬細胞。qRT-PCR結果表明, Myo9bmRNA水平在人AAA組織中顯著高于正
25、常腹主動脈組織。相關性分析結果顯示,KLF5mRNA水平與AAA的膨脹率的相關性并不明顯(P>0.05),但是Myo9bmRNA水平與AAA的膨脹率具有顯著正相關性(P<0.05)。
小結:
敲低Myo9b能顯著減少TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移。在巨噬細胞中,KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP的水平;KLF5通過上調Myo9b表達而抑制RhoA信號途徑以及podosome的形成。巨噬細胞中
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