益氣化痰祛瘀方介導NO-cGMP-KATP途徑對COPD肺血管舒張作用的機制研究.pdf

1、1、目的：
　　在中醫(yī)理論指導下，探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)生發(fā)展的病機演變，并以NO-cGMP-KATP途徑為切入點，分別從離體血管、動物水平和細胞水平觀察益氣化痰祛瘀方—芪白平肺膠囊對 COPD肺血管的舒張作用，探討COPD發(fā)生發(fā)展過程中，NO/cGMP通路與KATP通道的相關(guān)性，探究益氣化痰祛瘀方—芪白平肺膠囊防治COPD肺動脈高壓的分子機制，為防治COPD肺動脈高壓提供依據(jù)。
　　2、方法：
　　2.1

2、離體肺動脈環(huán)實驗研究
　　分離第3～4級肺動脈用于制備離體大鼠肺動脈環(huán)，采用四通道離體微血管張力測定系統(tǒng)依次觀察益氣化痰祛瘀方—芪白平肺膠囊在不同濃度(0.125 g/Kg,0.25 g/Kg,0.5 g/Kg,1 g/Kg,2 g/Kg)對收縮劑U46619誘導的肺血管收縮效應的影響。并觀察在不同阻斷劑L-NAME、ODQ、GLYB預孵育下，對芪白平肺膠囊舒張作用的影響。
　　2.2動物實驗研究
　　SPF級大鼠隨機

3、分為6組：正常組、模型組、芪白平肺高劑量組、芪白平肺中劑量組、芪白平肺低劑量組和尼可地爾對照組，每組20只。采用復合因素復制 COPD痰瘀阻肺證大鼠模型，造模結(jié)束后，觀察大鼠宏觀體征、肺功能、血流動力學檢測、Masson染色病理形態(tài)學變化，評價模型建立及其對COPD痰瘀阻肺證大鼠的影響，Elisa測定大鼠血清一氧化氮(NO)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)濃度變化，免疫組化檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表達

4、，分別采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測KATP通道Kir6.1和SUR2B mRNA和蛋白的表達。
　　2.3細胞實驗研究
　　SPF級大鼠給予芪白平肺膠囊顆粒連續(xù)灌胃10日，制備芪白平肺含藥血清。采用組織塊貼壁法，體外培養(yǎng)原代大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)；MTT法檢測低氧條件下QBPF對PASMCs增值的影響，篩選出最佳反應時間；RT-qPCR檢測PASMC

5、s內(nèi)Kir6.1和SUR2B基因 mRNA水平，Western blot不同低氧時間下Kir6.1和SUR2B的表達，以及芪白平肺含藥血清對其表達的影響。
　　3、結(jié)果：
　　3.1離體肺動脈環(huán)實驗研究
　　3.1.1芪白平肺膠囊對正常大鼠肺動脈環(huán)舒張作用的影響
　　芪白平肺膠囊對U46619誘導的內(nèi)皮完整的正常大鼠肺動脈環(huán)收縮具有一定的舒張作用，并呈一定的濃度依賴關(guān)系，半數(shù)有效濃度(EC50)為0.56g/L，

6、最大舒張率為84.30±6.27％(P<0.01)。與內(nèi)皮完整的肺動脈環(huán)相比，內(nèi)皮剝奪后的肺動脈收縮作用，以及芪白平肺膠囊對肺動脈環(huán)的舒張作用均顯著減弱，EC50為1.33g/L，最大舒張率為47.91±4.09%(P<0.01)。
　　3.1.2 L-NAME、ODQ對芪白平肺膠囊舒張大鼠肺動脈環(huán)作用的影響
　　L-NAME預孵育組的最大舒張率為45.81±8.72%，ODQ預孵育組的最大舒張率為50.42±7.5%，與正

7、常大鼠內(nèi)皮完整組的血管舒張率相比，具有顯著差異(P<0.01)，與內(nèi)皮剝奪組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.1.3 GLYB對芪白平肺膠囊舒張大鼠肺動脈環(huán)作用的影響
　　GLYB能部分阻斷由芪白平肺膠囊介導的肺動脈環(huán)舒張(P<0.01, Emax:84.30±6.27 in control，51.34±9.58% in GLYB-QBPF)。
　　3.1.4芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證大鼠肺動脈環(huán)張力的

8、影響
　　痰瘀阻肺證大鼠對U446619誘導的肺動脈的血管收縮能力，以及芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證大鼠肺動脈環(huán)的舒張作用，均顯著減弱(P<0.01)。與正常大鼠（Emax=84.30±6.27%，EC50=0.72g/L）相比，芪白平肺膠囊誘導的肺動脈環(huán)最大舒張率下降22.22%，最大舒張率為62.63%±10.02，EC50為0.72g/L。
　　3.2動物實驗研究
　　3.2.1宏觀體征觀察
　　模型組

9、大鼠的反應較正常組遲緩，精神萎靡，常拱背蜷臥，皮毛不華，飲水進食減少，體重增幅減少甚至不增加，伴有咳嗽、噴嚏，呼吸急促，口鼻分泌物增多，可聞及氣道痰鳴音，隨著低氧進程，可觀察到鼻部、唇周及爪甲紫紺，符合 COPD痰瘀阻肺證的相關(guān)表現(xiàn)。芪白平肺膠囊各劑量組和尼可地爾組相關(guān)癥狀得到不同程度的改善。正常組未見明顯異常。3.2.2芪白平肺膠囊對大鼠肺功能參數(shù)的影響
　　與正常組大鼠相比，模型組大鼠的FEV0.3， FVC和FEV0.3/F

10、VC的肺功能參數(shù)值顯著下降(P<0.01)，芪白平肺膠囊高、中、低劑量組和尼可地爾組的肺功能參數(shù)值均有不同程度的改善(P<0.01)。
　　3.2.3芪白平肺膠囊對大鼠血氣的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠的pH、動脈PaO2、SaO2的值顯著性降低(P<0.01)，而動脈PaCO2的值顯著性升高(P<0.01)。給予不同劑量芪白平肺膠囊治療后，其pH、動脈PaO2的值與模型組相比，均有不同程度上升，而動脈PaCO2的值顯

11、著性顯著性降低(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.4芪白平肺膠囊對大鼠右心室收縮壓、平均肺動脈壓及心室肥厚度的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠的RVSP、mPAP和RV/(LV+S)均有顯著性升高(P<0.01)。給予不同劑量芪白平肺膠囊治療后，其RVSP、mPAP和RV/(LV+S)均有不同程度的降低(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.5芪白平肺膠囊對大鼠肺小動脈形態(tài)學影響
　　結(jié)果表

12、明，與正常對照組相比，模型組大鼠的肺小動脈顯著增厚，中膜紅色的肌纖維明顯增生，外膜的藍色膠原纖維增生，血管周圍和組織間隙有大量炎性細胞浸潤。而不同劑量芪白平肺和陽性對照尼可地爾可不同抑制抑制肺血管肌纖維和膠原纖維增生。
　　3.2.6芪白平肺膠囊對大鼠血清NO、cGMP含量的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠的NO和cGMP顯著性下調(diào)(P<0.01)，而芪白平肺高劑量組、中劑量組和尼可地爾組的NO含量和芪白平肺高劑量組、中劑

13、量組、低劑量組和尼可地爾組的cGMP含量升高(P<0.05或P<0.01)。
　　3.2.7芪白平肺膠囊對大鼠肺動脈eNOS、iNOS表達的影響
　　正常組大鼠肺血管內(nèi)皮eNOS強陽性表達，平滑肌iNOS弱陽性表達，芪白平肺膠囊高、中、低劑量和尼可地爾能不同程度上調(diào)eNOS，下調(diào)iNOS的相對表達(P<0.05，或P<0.01)。
　　3.2.8芪白平肺膠囊對大鼠Kir6.1、 SUR2B基因 mRNA表達的影響

14、>　　結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織的Kir6.1 mRNA和SUR2B mRNA呈現(xiàn)顯著的下降(P<0.01)，與模型組相比，芪白平肺膠囊高、中、低劑量組和尼可地爾組分別經(jīng)過藥物干預后，能提升Kir6.1 mRNA和SUR2B mRNA水平的表達(P<0.05或P<0.01)。
　　3.2.9芪白平肺膠囊對大鼠KIR6.1、 SUR2B蛋白表達的影響
　　為了深入研究芪白平肺膠囊對KATP通道的調(diào)控作用，各組大鼠

15、肺組織KIR6.1和 SUR2B蛋白表達被檢測。結(jié)果表明，與正常組相比，模型組SUR2B蛋白的表達顯著下調(diào)，而芪白平肺膠囊不同劑量和尼可地爾能顯著上調(diào)其表達( P<0.01，或P<0.05)，KIR6.1蛋白上調(diào)和下調(diào)的趨勢不顯著(P>0.05)
　　3.3細胞實驗研究
　　3.3.1大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的形態(tài)學特征
　　原代大鼠肺動脈平滑肌組織塊貼壁第3～5天可見貼壁附近有少量不規(guī)則長梭形細胞爬出，后

16、呈放射性生長，約7～10天成束的細胞平行排列，部分區(qū)域細胞呈多層重疊，部分區(qū)域呈單層，高低起伏，呈現(xiàn)平滑肌細胞特征性的“峰-谷”狀致密分布。激光掃描共聚焦顯微鏡下，觀察到胞質(zhì)中有較強的呈絲狀分布的綠色熒光，為平滑肌α-肌動蛋白，細胞核呈長桿形或卵圓形藍色熒光。
　　3.3.2不同時間點各濃度HYXQ對大鼠PASCMs增殖的影響
　　MTT結(jié)果表明，與常氧組相比，低氧12h、24h、48h、72h，OD值均顯著增加，PASCM

17、s出現(xiàn)增殖，(P<0.01)，各時間點，5%、10%、20%濃度HYXQ能不同程度抑制低氧誘導的PASCMs增殖，OD值顯著降低(P<0.05或P<0.01)。其抑制作用以低氧24h的20%QBPF組最顯著。
　　3.3.3不同時間低氧對PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表達的影響
　　結(jié)果表明：與各低氧組相比，常氧狀態(tài)下(即低氧0h組)，PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表達維持在較低水平(P<0.01)，

18、隨著低氧時間延長，低氧6h和低氧12h的Kir6.1和SUR2B蛋白表達開始上升，代表KATP通道開放，蛋白表達在低氧24h達到高峰(P<0.01)，隨著低氧時間延長，低氧48h、72h的蛋白表達出現(xiàn)不同程度下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。
　　3.4 HYXQ對PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表達的影響
　　結(jié)果表明，與常氧組相比，低氧組、20% HYXQ組和10% HYXQ組和5%HYXQ組 PASMCs中

19、 Kir6.1和 SUR2B蛋白的表達均顯著增加(P<0.01)，且20% HYXQ組和10% HYXQ組PASMCs中的Kir6.1和SUR2B蛋白表達高于低氧組(P<0.05或P<0.01)。
　　3.5 GLYB對HYXQ干預PASMCsKir6.1和SUR2B蛋白表達的影響
　　結(jié)果表明，與常氧組相比，低氧組、20% HYXQ組PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表達均顯著增加(P<0.01)，而不同濃度GL

20、YB干預后，高劑量GLYB和中劑量GLYB組能顯著下調(diào)甚至阻斷Kir6.1和SUR2B蛋白的表達水平(P<0.01)。
　　3.6 L-NAME對HYXQ干預PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表達的影響
　　結(jié)果表明，與常氧組相比，低氧組、20% HYXQ組PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表達均顯著增加( P<0.01)，而不同濃度L-NAME干預后，高劑量L-NAME和中劑量L-NAME組能顯著下調(diào)Ki

21、r6.1和SUR2B蛋白的表達水平(P<0.05或P<0.01)。
　　4、結(jié)論：
　　本課題分別從大鼠宏觀體征、肺功能、血氣分析、血流動力學評價和肺血管形態(tài)學分析等方面，驗證采用多因素方法復制的 COPD痰瘀阻肺證大鼠模型成功。
　　基于“益氣、化痰、祛瘀”之法創(chuàng)立的益氣化痰祛瘀方—芪白平肺膠囊具有顯著的舒張肺血管，改善模型大鼠的肺功能參數(shù)、降低平均肺動脈，緩解肺血管形態(tài)學改變，抑制低氧誘導的 PASMCs異常增殖的