B7-H4在膽管癌免疫逃逸中的作用和臨床意義的初步研究.pdf

1、一、研究背景
　　膽管癌作為一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在我國消化系統(tǒng)腫瘤中排名第五，其發(fā)病率每年仍有增高的趨勢。流行病學(xué)調(diào)查顯示膽管癌患者發(fā)病年齡多為50-60歲，男性多于女性。膽管癌的發(fā)病率具有一定民族和區(qū)域分布差異，多發(fā)生亞洲，特別是東南亞以及中東國家，我國主要是華南以及東南沿海發(fā)病率較高。近些年，隨著環(huán)境不斷惡化以及臨床診斷技術(shù)的發(fā)展進步，世界范圍內(nèi)膽管癌發(fā)病率的呈逐年上升趨勢。盡管膽管癌的發(fā)病率仍低于消化系統(tǒng)其他惡性腫瘤，

2、但是患者的死亡率卻一直處于較高水平。膽管癌所處的特殊解剖部位以及高侵襲轉(zhuǎn)移能力，是造成高死亡率的主要原因。目前針對膽管癌的治療方法中，膽管癌根治性切除術(shù)是提高患者預(yù)后降低死亡率的主要手段。但是由于膽管癌起病隱匿、臨床表現(xiàn)不典型以及缺乏早期診斷標(biāo)志物，部分患者就診時腫瘤已經(jīng)進入晚期，有些甚至已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而失去了手術(shù)切除腫瘤的最佳時機。部分膽管癌患者即使接受根治性手術(shù)切除，腫瘤復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險仍然偏高。以上這些因素嚴(yán)重影響了膽管癌根治

3、性切除術(shù)的遠(yuǎn)期療效。近年來，針對膽管癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機制研究已經(jīng)取得一定的進展，但是涉及到膽管癌的免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究還不是很完善。所以我們把研究的重點放在了膽管癌的腫瘤微環(huán)境，特別是免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究上。通過相關(guān)內(nèi)容的研究，我們嘗試發(fā)現(xiàn)新的分子以及相關(guān)通路作為診斷和治療靶點，并且能夠為創(chuàng)新臨床診斷和治療的方法提供理論依據(jù)。
　　T細(xì)胞免疫作為腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起

4、到十分關(guān)鍵的作用。其中T細(xì)胞的活化和增殖需兩種信號途徑。第一條信號途徑是抗原遞呈細(xì)胞通過呈遞抗原肽并且與T細(xì)胞受體識別，傳遞活化信號。第二條信號途徑是通過協(xié)同刺激信號分子活化T細(xì)胞。協(xié)同刺激分子決定了T細(xì)胞是被激活并且增殖還是轉(zhuǎn)為抑制或者無應(yīng)答狀態(tài)。目前所知的協(xié)同刺激分子主要分為三類：腫瘤壞死因子家族、細(xì)胞因子家族以及B7家族。其中B7家族包括了B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-DC和B7-H4。B7家族作為

5、重要的協(xié)同刺激分子，它們不僅能起到促進T細(xì)胞增殖活化以及產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用，同時也能起到抑制、限制或者減弱 T細(xì)胞反應(yīng)的作用。B7-H4作為協(xié)同刺激分子B7家族中的成員，主要提供負(fù)性調(diào)節(jié)信號，通過抑制T細(xì)胞增殖、分泌相關(guān)細(xì)胞因子以及降低T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力，從而促進腫瘤細(xì)胞逃過宿主免疫監(jiān)視進而發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象；同時，B7-H4在部分腫瘤中特異性表達(dá)，還可以增強腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。既往文獻(xiàn)報道，B7-H4在多種腫

6、瘤中存在異常表達(dá)，并且與腫瘤臨床病理指標(biāo)以及病人預(yù)后密切相關(guān)。
　　由于B7-H4在協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫監(jiān)視以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了十分重要的作用。根據(jù)既往研究成果以及前期研究結(jié)果，對B7-H4在膽管癌免疫逃逸中的作用和臨床意義進行初步研究，并提出研究假設(shè)：B7-H4在膽管癌患者中特異性表達(dá)增高，并且通過抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫淋巴細(xì)胞，降低對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，從而促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。同時B7-H4還可促進膽管癌細(xì)胞發(fā)生

7、惡性轉(zhuǎn)化，增強癌細(xì)胞自身侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　二、研究方法
　　為了驗證上述假設(shè)，首先，通過免疫組化檢測統(tǒng)計B7-H4在膽管癌病人中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與臨床病理特征以及患者預(yù)后的關(guān)系，并分析腫瘤組織和非腫瘤組織中B7-H4的差異表達(dá)的情況；其次，通過免疫組化分別統(tǒng)計腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)中 CD4，CD8陽性T淋巴細(xì)胞浸潤情況與B7-H4陽性表達(dá)之間的聯(lián)系，分析B7-H4是否抑制T淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中浸潤的情況；再次，在體外

8、試驗中干擾B7-H4在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，分析B7-H4表達(dá)水平的改變對細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的殺傷作用和相關(guān)細(xì)胞因子分泌情況的影響。最后，通過下調(diào)B7-H4在膽管癌細(xì)胞中表達(dá)水平，觀察膽管癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化情況。本項研究目的在于探討B(tài)7-H4在膽管癌中的表達(dá)情況以及相關(guān)臨床意義，以及它如何促進膽管癌細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生免疫逃逸以及惡性轉(zhuǎn)化，尤其是增強癌細(xì)胞侵襲遷移能力的可能機制，開拓膽管癌發(fā)生腫瘤免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的研究思路，為發(fā)

9、現(xiàn)新的膽管癌預(yù)后指標(biāo)以及新的免疫治療靶點提供科學(xué)研究依據(jù)。
　　1.收集從2005年至2012年第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科研究所進行根治性切除并經(jīng)病理診斷明確為膽管癌的病例。上述收集的病例均未進行放療或者化療。同時收集19例慢性膽管炎、8例膽管腺瘤標(biāo)本和18例膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本。收集的臨床資料包括病人性別、年齡、腫瘤位置、大小、分化程度、分期分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況。采用免疫組化的方法檢測 B7-H4在各種組織中

10、的表達(dá)情況，并對比腫瘤組織和非腫瘤組織中B7-H4的表達(dá)差異；同時分析B7-H4與患者臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2.收集110例膽管癌患者腫瘤組織，進行免疫組化染色，檢測統(tǒng)計CD4、CD8陽性T淋巴細(xì)胞分別在腫瘤實質(zhì)以及腫瘤間質(zhì)組織中的浸潤表達(dá)情況，并結(jié)合對應(yīng)患者的B7-H4表達(dá)情況，分析B7-H4與CD4、CD8陽性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況的相關(guān)性。
　　3.收集110例膽管癌患者臨床隨訪資料（包括患者術(shù)后總存活時間和無瘤生存

11、時間）。總生存時間的計算方式是從病人手術(shù)時間到病人死亡時間或者最后一次聯(lián)系隨訪時間；無瘤生存時間的計算方式是從病人手術(shù)時間到發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的時間。腫瘤的復(fù)發(fā)主要依靠影像學(xué)以及病理診斷為主。單因素生存分析采用KM法（KM method），多因素分析采用Cox多因素逐步回歸（向前，極大似然法）。分析B7-H4在腫瘤組織中的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　4.選擇膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE作為研究對象，利用慢病毒作為載體，構(gòu)建shR

12、NA-B7-H4序列，下調(diào)兩株細(xì)胞中 B7-H4的表達(dá)水平，然后將其與細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對膽管癌細(xì)胞殺傷作用的變化情況。同時還檢測共培養(yǎng)后培養(yǎng)基上清液相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的變化情況。
　　5.選擇膽管癌細(xì)胞株 QBC939和RBE作為研究對象，利用慢病毒作為載體，構(gòu)建shRNA-B7-H4序列，下調(diào)兩株細(xì)胞中 B7-H4的表達(dá)水平，然后通過觀察兩株膽管癌細(xì)胞的損傷修復(fù)實驗、Transwell侵襲實驗

13、，觀察B7-H4表達(dá)對膽管癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。
　　三、研究結(jié)果
　　1.在110例患者的膽管癌組織中，54例呈B7-H4染色陽性，陽性率為49％；8例膽管腺瘤組織中，全部呈 B7-H4染色陰性；19例慢性膽管炎組織中，4例呈 B7-H4染色陽性，陽性率為21.1%。本部分結(jié)果提示：B7-H4在腫瘤組織中表達(dá)的陽性率明顯高于非腫瘤組織，B7-H4在膽管癌組織中表達(dá)異常增高。通過分析B7-H4表達(dá)情況和患者臨床病理特征

14、的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：B7-H4的表達(dá)與腫瘤分期，分級和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)；而與性別、年齡、部位，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。本部分結(jié)果提示：B7-H4的異常表達(dá)可能與腫瘤惡性程度以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.在110例患者的膽管癌腫瘤間質(zhì)組織中，CD4陽性T淋巴細(xì)胞輕度浸潤97例，重度浸潤13例；CD8陽性T淋巴細(xì)胞輕度浸潤56例，重度浸潤54例。在110例患者的膽管癌腫瘤實質(zhì)組織中，CD4陽性T淋巴細(xì)胞輕度浸潤88例，重度浸潤22例；CD8陽性T淋巴細(xì)胞輕

15、度浸潤76例，重度浸潤34例。膽管癌組織中B7-H4的表達(dá)水平與 CD8陽性 T淋巴細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞浸潤程度有關(guān)。本部分結(jié)果提示：B7-H4分子作為一個負(fù)性免疫調(diào)控分子，可能通過降低CD8陽性T淋巴細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞浸潤的程度，從而在促進膽管癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸中起到重要作用。
　　3.通過對110膽管癌患者生存數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。Kaplan—Meier模型分析提示：B7-H4陽性組患者生存時間明顯低于B7-H4陰性組患者。按照相同方法

16、發(fā)現(xiàn)：B7-H4陽性組患者復(fù)發(fā)時間明顯低于B7-H4陰性組患者。為了排除相關(guān)混雜因素的干擾，將患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度以及B7-H4表達(dá)情況帶入Cox模型中進行術(shù)后存活時間以及復(fù)發(fā)時間的多因素相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：B7-H4陽性表達(dá)是判定患者術(shù)后存活時間和復(fù)發(fā)時間的一個相對獨立危險因素。本部分結(jié)果提示：B7-H4陽性表達(dá)與膽管癌患者預(yù)后較差顯著相關(guān)而且可以作為判斷患者預(yù)后的獨立分子標(biāo)志物。
　　4.通過Western-b

17、lot方法檢測，發(fā)現(xiàn)：兩株膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE均有 B7-H4蛋白的表達(dá)。采用慢病毒轉(zhuǎn)染 shRNA-B7-H4進入細(xì)胞株，成功下調(diào)B7-H4表達(dá)水平；在效靶比為（20:1或者10:1）時，特異性CD8+CTL對B7-H4表達(dá)水平下調(diào)的膽管癌細(xì)胞殺傷能力明顯高于對照組的殺傷能力。淋巴細(xì)胞和B7-H4表達(dá)水平下調(diào)的膽管癌細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，TGF-β，IL-6細(xì)胞因子分泌水平明顯低于對照組。本部分結(jié)果提示 B7-H4有可通過能增

18、強細(xì)胞因子 TGF-β，IL-6的分泌水平，誘導(dǎo)CD8陽性T分化為不具有細(xì)胞毒性Th17，從而降低CD8+CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。
　　5．采用慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-B7-H4進入細(xì)胞株，成功下調(diào)B7-H4表達(dá)水平；通過觀察損傷修復(fù)實驗、Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)膽管癌細(xì)胞中B7-H4蛋白表達(dá)水平能明顯抑其癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。本部分結(jié)果提示：B7-H4明顯促進了膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　四、研究結(jié)論