新型免疫調(diào)節(jié)分子VSIG4對Ⅱ型膠原誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展的影響.pdf

1、目的：以牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生型（基因背景：C57BL/6）關(guān)節(jié)炎模型小鼠為研究對象，探討新型免疫調(diào)節(jié)分子VSIG4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程中的影響。進(jìn)一步構(gòu)建 VSIG4-Fc重組慢病毒載體和穩(wěn)定表達(dá) VSIG4-Fc的RAW264.7細(xì)胞株，并初步探討VSIG4-Fc對巨噬細(xì)胞活化的影響。
　　方法：首先將VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）小鼠，以牛Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）與

2、完全弗氏佐劑完全乳化制成乳劑后尾根部皮下注射，在第21天以牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫獲得CIA模型。與同系正常小鼠比較分析小鼠關(guān)節(jié)改變，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎臨床評分。用H&E染色法檢測小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變、免疫組織化學(xué)染色法檢測關(guān)節(jié)中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等細(xì)胞因子的變化，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞以及腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α的變化。接下來將VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生

3、型C57BL/6小鼠，以牛Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）與完全弗氏佐劑完全乳化制成乳劑后尾根部皮下注射，在第21天以牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫獲得膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，定期觀察關(guān)節(jié)改變，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎臨床評分。H&E染色觀察小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色法檢測關(guān)節(jié)中 TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及 IL-17等細(xì)胞因子的變化。進(jìn)一步將目的基因VS

4、IG4-Fc和PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV慢病毒載體以ECORⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切后連接，獲得表達(dá)VSIG4-Fc的慢病毒載體，與輔助病毒載體以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，獲得病毒上清后將其感染于RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。采用western blot法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中VSIG4的表達(dá)。進(jìn)一步使用定量 PCR法體外分析 VSIG4-Fc融合蛋白對骨髓來源巨噬細(xì)胞(BM-derived ma

5、crophages，BMDM)及其TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等細(xì)胞因子分泌的影響。
　　結(jié)果：1. VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型膠原蛋白免疫后第9天開始出現(xiàn)明顯的多關(guān)節(jié)腫脹。小鼠踝關(guān)節(jié)病理檢測結(jié)果顯示明顯的滑膜增生，炎癥細(xì)胞浸潤以及關(guān)節(jié)壞死。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來源于 VSIG4-/- CIA小鼠與同系正常小鼠相比，雖然脾淋巴CD4+T細(xì)胞分泌的TNF-α沒有顯著性差異（P>0.05），但是腹腔巨噬細(xì)胞分

6、泌的TNF-α具有顯著性差異（P<0.05）。此外，VSIG4-/-CIA小鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)明顯高于同系正常小鼠(P<0.05)。
　　2.VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生型（基因背景：C57BL/6） CIA小鼠均在初次免疫后第8天開始后腳掌出現(xiàn)明顯的紅腫，并且在初次免疫后第33天開始，VSIG4-/-模型組臨床評分明顯高于野生型模型組小鼠（P

7、<0.05）。小鼠踝關(guān)節(jié)病理檢測結(jié)果顯示明顯的滑膜增生，炎癥細(xì)胞浸潤以及關(guān)節(jié)壞死，并且VSIG4-/- CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL-Iβ、IL-17、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)明顯高于野生型CIA小鼠（P<0.05）。
　　3.成功構(gòu)建表達(dá)VSIG4-Fc的慢病毒載體，并獲得穩(wěn)定表達(dá)VSIG4-Fc基因的細(xì)胞株，鑒定結(jié)果顯示其穩(wěn)定高表達(dá) VSIG4。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VSIG4-Fc融合蛋白可抑制炎癥巨噬細(xì)胞所分泌的TNF

8、-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子。
　　結(jié)論：牛Ⅱ型膠原蛋白可誘導(dǎo) VSIG4-/-小鼠的關(guān)節(jié)炎，其中腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α在其發(fā)病過程中可能起關(guān)鍵作用。且 VSIG4的基因敲除可加?、蛐湍z原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥。并且 VSIG4-Fc融合蛋白可抑制巨噬細(xì)胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等炎癥因子。此外，穩(wěn)定表達(dá)VISG4-Fc的RAW264.7轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的成功構(gòu)建