攜載CA-125抗體的超聲納米泡在靶向診斷卵巢癌中的實驗研究.pdf

1、目的：以CA-125抗體作為配體，制備一種靶向卵巢癌的新型超聲納米泡造影劑，鑒定其理化特性及其對卵巢癌高表達CA-125的OVCAR-3細胞的靶向性，并探討該造影劑對卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的特異增強顯像效果，以期建立敏感的實驗性卵巢癌超聲早期診斷方法。
　　方法：
　　1.非靶向及靶向超聲納米泡造影劑的制備：將一定比例的DPPC、DPPA、DPPE和DSPE-PEG-COOH與氯仿、Pluronic L10溶液、甘油等混合均勻

2、，采用干燥法、機械振蕩法等，制備非靶向超聲納米泡造影劑。通過EDC與NHS將CA-125抗體與非靶向超聲納米泡造影劑連接，制備靶向卵巢癌的超聲納米泡造影劑。
　　2.非靶向及靶向超聲納米泡造影劑物理性質(zhì)評價：DLS檢測儀檢測靶向及非靶向超聲納米泡的粒徑大小范圍、分散度；并用超聲診斷儀檢測靶向超聲納米泡體外超聲造影顯像效果。檢測三組不同溫度下（4℃組、25℃組、37℃組）靶向超聲納米泡在制備后三天內(nèi)的穩(wěn)定性及超聲造影顯像效果。模擬體

3、內(nèi)環(huán)境下，分別檢測靶向及非靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性。
　　3.靶向超聲納米泡造影劑與二抗的結(jié)合試驗：往非靶向及靶向超聲納米泡分別加入帶有綠色熒光的二抗MUC16 SAB，于4℃下透析30min，離心兩次后，取上清液。用熒光顯微鏡分別觀察靶向及非靶向超聲納米泡表面熒光二抗的附著情況，從而了解靶向超聲納米泡與抗體的結(jié)合情況。
　　4.靶向超聲納米泡造影劑的體外結(jié)合試驗：選擇人卵巢癌OVCAR-3細胞（對CA-125呈陽性表達）及S

4、KOV-3細胞（對CA-125呈陰性表達）體外無菌條件下分別培養(yǎng)傳代，在第3-4代細胞生長旺盛期，分別將OVCAR-3細胞和SKOV-3細胞固定。將固定好的OVCAR-3細胞分為a組、b組，SKOV-3細胞分為c組、d組。a,c組加入帶有綠色熒光的非靶向超聲納米泡造影劑，b,d組加入帶有綠色熒光的靶向超聲納米泡造影劑，使納米泡與細胞充分反應(yīng)3h，用PBS洗滌4次。即刻用熒光顯微鏡分別觀察靶向及非靶向超聲納米泡在體外分別與卵巢癌OVCAR

5、-3細胞及SKOV-3細胞的結(jié)合情況，從而了解靶向超聲納米泡與靶標的結(jié)合情況。
　　5.靶向超聲納米泡造影劑的體內(nèi)應(yīng)用試驗：人卵巢癌OVCAR-3細胞及SKOV-3細胞體外無菌條件下培養(yǎng)傳代，在第3-4代細胞生長旺盛期，Balb/c雌性裸鼠皮下分別接種，分別建立人卵巢癌裸鼠OVCAR-3細胞和SKOV-3細胞動物模型。經(jīng)裸鼠尾靜脈分別注入攜帶CA-125抗體的靶向超聲納米泡、間隔兩天后再分別注入非靶向超聲納米泡造影劑，在造影前15

6、秒開始采集圖像，連續(xù)采集10min動態(tài)圖像。繪制時間-強度曲線，對比分析同種細胞同一腫瘤實質(zhì)分別注入非靶向及靶向超聲納米泡后超聲造影峰值強度、達鋒后1min、2 min和5min超聲造影的增強強度及強度比值（同一腫瘤，靶向超聲納米泡強度值/非靶向超聲納米泡強度值）及兩種不同超聲納米泡的衰減斜率。
　　6.病理檢查：一周后，經(jīng)裸鼠尾靜脈注入帶有綠色熒光的靶向超聲納米泡造影劑，15min后將動物處死并切除腫瘤，用OCT包埋并放置-80

7、℃保存。將病理組織進行切片并將細胞核經(jīng)藍色DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察靶向超聲納米泡與人卵巢癌OVCAR-3腫瘤組織及SKOV-3腫瘤組織的結(jié)合情況，從而了解靶向超聲納米泡與靶標的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1. DLS檢測儀檢測靶向與非靶向超聲納米泡的平均粒徑大小分別為74.6±16.7 nm、66.6±22.0 nm，分散度分別為0.208±0.069，0.203±0.020。攜載大分子量CA-125抗體后靶向超聲納

8、米泡體外超聲造影顯像效果顯示為點狀高回聲，細膩均勻。
　　2.不同溫度下靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性：4℃組在靶向超聲納米泡制備后第一天～制備后第三天可保持較小粒徑，25℃組和37℃組于制備后第二天開始粒徑明顯增大。體外超聲造影顯像效果顯示，4℃組和25℃組樣本于制備后三天內(nèi)仍可保持較好的超聲造影顯像效果，而37℃組樣本于制備后第一天超聲造影顯像效果明顯下降。
　　3.模擬體內(nèi)環(huán)境下靶向及非靶向超聲納米泡的穩(wěn)定性：非靶向與靶向超聲

9、納米泡在0-60 min、0-4h內(nèi)的造影增強強度值變化曲線相似。
　　4.靶向超聲納米泡造影劑與二抗的結(jié)合試驗：熒光顯微鏡下顯示靶向超聲納米泡樣本組中可呈現(xiàn)大量綠色熒光，非靶向超聲納米泡樣本組中綠色熒光極少，經(jīng)Image J定量分析，兩組綠色熒光值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05），從而說明二抗與靶向超聲納米泡造影劑牢固、特異性地結(jié)合在一起。
　　5.靶向超聲納米泡造影劑的體外結(jié)合試驗：熒光顯微鏡下，b組（靶向超聲納米泡組

10、）OVCAR-3細胞核周圍可見大量綠色熒光圍繞或黏附，而a組（非靶向超聲納米泡組）OVCAR-3細胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。而d組（靶向超聲納米泡組）和c組（非靶向超聲納米泡組），在SKOV-3細胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。經(jīng)Image J定量分析結(jié)果提示，b組的總超聲納米泡熒光強度與細胞熒光強度比值（超聲納米泡的總熒光強度/細胞的總熒光強度），與其余三組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，且卵巢癌OVCAR-3細胞表面所結(jié)合的靶

11、向超聲納米泡，最高可達該細胞表面所結(jié)合的非靶向超聲納米泡的12倍。
　　6.靶向超聲納米泡造影劑的體內(nèi)應(yīng)用試驗：繪制TIC曲線后，對比分析OVCAR-3腫瘤細胞組，同一裸鼠腫瘤實質(zhì)分別注入靶向、非靶向超聲納米泡后峰值強度、達鋒后1min、2 min和5min超聲造影增強的強度比值（同一腫瘤，靶向超聲納米泡強度值/非靶向超聲納米泡強度值）差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。該組裸鼠腫瘤注入靶向超聲納米泡、非靶向超聲納米泡后起始相的平均衰減斜率分別

12、為0.39±0.06、0.98±0.20，盡管靶向超聲納米泡起始相的平均衰減斜率低于非靶向超聲納米泡，但是經(jīng)配對t檢驗，對比分析該組同一裸鼠腫瘤實質(zhì)分別注入兩種不同超聲納米泡后起始相衰減斜率、終末相衰減斜率差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而對比分析SKOV-3腫瘤細胞組，同一裸鼠腫瘤實質(zhì)分別注入靶向、非靶向超聲納米泡后峰值強度、達鋒后1min、2 min和5min超聲造影增強的強度比值（同一腫瘤，靶向超聲納米泡強度值/非靶向超聲納米泡強度值）差異

13、均無統(tǒng)計學(xué)意義。對比分析該組同一裸鼠腫瘤實質(zhì)分別注入兩種不同超聲納米泡后起始相衰減斜率、終末相衰減斜率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7.病理檢查：熒光顯微鏡下對CA-125呈陽性表達的卵巢癌OVCAR-3細胞核周圍可見大量綠色熒光圍繞或黏附，而對CA-125呈陰性表達的卵巢癌SKOV-3細胞核周圍未見或僅見極少量綠色熒光。使用Image J定量分析結(jié)果顯示，OVCAR-3腫瘤細胞的總超聲納米泡熒光強度與細胞熒光強度比值明顯高于SKOV

14、-3腫瘤細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1．超聲納米泡造影劑的大小、穩(wěn)定性及超聲顯像效果適合作為血管外造影劑。
　　2．通過EDC與NHS將CA-125抗體結(jié)合到超聲納米泡表面，成功制備靶向超聲納米泡造影劑。連接CA-125抗體后超聲納米泡仍保持小粒徑和較高的穩(wěn)定性。4℃為保存靶向超聲納米泡的最佳溫度，于制備后三天仍可保持較小粒徑及良好的超聲造影顯像效果。
　　3．在體外觀察靶向超聲納米泡的尋靶能力，

15、發(fā)現(xiàn)靶向納米泡與相應(yīng)配體結(jié)合牢固，攜帶了CA-125抗體的靶向超聲納米泡在體外能高效、特異性地與CA-125呈陽性表達的人卵巢癌OVCAR-3細胞結(jié)合，而與CA-125呈陰性表達的人卵巢癌SKOV-3細胞不能結(jié)合或結(jié)合率極低。
　　4.攜帶CA-125抗體的靶向超聲納米泡在動物體內(nèi)超聲造影實驗結(jié)果表明，靶向超聲納米泡可高效、特異性地聚集在靶區(qū)，靶向超聲納米泡可以明顯增強CA-125呈陽性表達的人卵巢癌OVCAR-3皮下移植瘤的顯像