水菖蒲乙酸乙酯提取物對(duì)腸道內(nèi)分泌激素GLP-1表達(dá)分泌的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　本論文探討水菖蒲乙酸乙酯提取物(ACE)的抗糖尿病作用及其對(duì)腸道胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)表達(dá)和分泌的影響，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行研究，為水菖蒲抗糖尿病的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)和方向，為藥物抗糖尿病作用及基于GLP-1的分子機(jī)制研究提供思路和方法。
　　研究方法:
　　1.水菖蒲乙酸乙酯提取物基于GLP-1的體內(nèi)抗糖尿病藥效和機(jī)制研究
　　采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)高血糖小鼠、遺傳性肥胖型db

2、/db糖尿病小鼠、飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠對(duì)ACE進(jìn)行體內(nèi)抗糖尿病藥效學(xué)評(píng)價(jià)。采用同周齡同背景小鼠作為正常對(duì)照組，糖尿病模型小鼠按血糖隨機(jī)分為3組，分別為模型對(duì)照組、二甲雙胍100 mg/kg陽(yáng)性藥對(duì)照組和ACE100 mg/kg組，連續(xù)灌胃給藥4-5周后處死小鼠，留取血樣以及胰腺和腸道組織樣本，-80℃保存，測(cè)定GLP-1相關(guān)藥效和機(jī)制指標(biāo)。給藥期間采用快速血糖儀常規(guī)檢測(cè)小鼠血糖或口服葡萄糖耐量，評(píng)價(jià)藥物抗糖尿病藥效。
　　通

3、過(guò)血漿胰島素ELISA檢測(cè)、胰島組織HE染色、免疫熒光染色等方法探討藥物對(duì)胰島素分泌和胰島功能的影響，并采用ELISA、RT-PCR和免疫熒光法對(duì)血漿GLP-1水平、腸道GLP-1相關(guān)基因gcg、 pc3表達(dá)變化以及GLP-1原位表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，觀察藥物的抗糖尿病藥效及其對(duì)GLP-1表達(dá)和分泌的影響。
　　2.水菖蒲乙酸乙酯提取物基于GLP-1的體外效應(yīng)及分子機(jī)制研究
　　采用人腸道L細(xì)胞NCI-H716進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)

4、ACE在不同條件下對(duì)GLP-l表達(dá)與分泌的影響，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　基礎(chǔ)狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)方法:NCI-H716細(xì)胞分化兩天，加藥前更換為KRB緩沖液+0.2％ BSA，以1∶1000體積比給予DMSO、二甲雙胍MET(1 mM)或ACE(12.5μg/ml)，37℃孵育2h，收集上清液，加入50μg/ml蛋白酶抑制劑PMSF，于-80℃凍存待測(cè);收取細(xì)胞以備后續(xù)機(jī)制研究。
　　病理狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)方法:其他條件均同基礎(chǔ)狀態(tài)

5、，在加藥前更換KRB+0.2％ BSA后，給予棕櫚酸(0.5 mM)造模并設(shè)立正常對(duì)照組，再以1∶1000體積比給予模型組DMSO、二甲雙胍MET(1 mM)或ACE(12.5μg/ml)，37℃孵育2h，收集上清液，加入50μg/ml PMSF，于-80℃凍存待測(cè);收取細(xì)胞以備后續(xù)機(jī)制研究。
　　檢測(cè)方法如下:
　　(1)采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GLP-1水平和細(xì)胞內(nèi)第二信使腺苷酸環(huán)化酶cAMP水平;
　

6、　(2)采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GLP-1原位表達(dá);
　　(3)采用Lowery法檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度;
　　(4)采用核質(zhì)分離法分離細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白;
　　(5)采用Western blotting法檢測(cè)胰島素受體信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白水平，PKA及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.水菖蒲乙酸乙酯提取物對(duì)糖尿病動(dòng)物體內(nèi)降糖作用的影響
　　(1) ACE對(duì)STZ誘導(dǎo)高血糖小

7、鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃給藥4周后，與模型對(duì)照組比較，ACE降低小鼠禁食血糖的幅度為27.9％（P＜0.05），二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組的降低幅度為32.9％（P＜0.01）。
　　(2) ACE對(duì)db/db糖尿病小鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃給藥5周，ACE可降低db/db糖尿病小鼠的禁食血糖，與模型對(duì)照組比較降低幅度為65.8％（P＜0.05），二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組的降低幅度為60.3％(P＜0.05)。
　　(3)

8、 ACE對(duì)DIO小鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃4周，ACE可降低DIO小鼠的禁食和隨機(jī)血糖，降低幅度分別是15.0％(P＜0.05)和12.7％（P＜0.01），同時(shí)還可改善其口服葡萄糖耐量。給藥4周后糖耐量曲線下面積AUC比模型對(duì)照組降低19.4％(P＜0.05)。上述作用強(qiáng)度與陽(yáng)性藥二甲雙胍相似。
　　2.水菖蒲乙酸乙酯提取物對(duì)糖尿病動(dòng)物血漿胰島素水平及胰島組織的影響
　　ACE可升高STZ高血糖小鼠、db/db糖尿

9、病小鼠和DIO小鼠的血漿胰島素水平，與模型對(duì)照組比較的升高幅度分別為43.7％（P＜0.01）、53.1％（P＜0.001）和77.1％（P＜0.001）。ACE可增加STZ高血糖小鼠的胰島素原位表達(dá)，并使胰島組織體積增大，邊緣清晰;能改善db/db小鼠的胰島組織病理形態(tài);并可增加DIO小鼠胰島素和Ki67在胰島組織的原位表達(dá)，提示其具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖作用。
　　3.水菖蒲乙酸乙酯提取物對(duì)糖尿病動(dòng)物GLP-1分泌和表達(dá)的影響<

10、br>　　ACE可增加STZ高血糖小鼠、db/db糖尿病小鼠和DIO小鼠的血漿GLP-1水平;并可促進(jìn)db/db小鼠和DIO小鼠GLP-1在腸道的原位表達(dá);促進(jìn)STZ小鼠和DIO小鼠的腸道GLP-1相關(guān)基因gcg和pc3表達(dá)，促進(jìn)db/db小鼠的pc3表達(dá)水平。
　　4.水菖蒲乙酸乙酯提取物在基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)腸道L細(xì)胞GLP-1表達(dá)與分泌的影響及其分子機(jī)制
　　在基礎(chǔ)狀態(tài)下，ACE可增加腸道L細(xì)胞NCI-H716細(xì)胞內(nèi)GLP-1

11、相關(guān)基因gcg和pc3的表達(dá)，同時(shí)還可增加細(xì)胞上清液內(nèi)GLP-1水平，提示其具有促進(jìn)GLP-1表達(dá)與分泌的作用。此外，這一過(guò)程伴隨著胰島素受體信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白胰島素受體底物1（IRS-1）酪氨酸989位點(diǎn)的磷酸化水平增高及其下游蛋白激酶B(PKB/Akt)絲氨酸473與蘇氨酸308位點(diǎn)磷酸化的增強(qiáng)。同時(shí)，ACE可增加細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，增加下游蛋白激酶A（PKA）磷酸化水平，以及增加Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-cat

12、enin在核內(nèi)的蛋白水平、減少胞漿內(nèi)水平，并增加該信號(hào)通路下游靶基因Cyclin D蛋白水平。
　　5.水菖蒲乙酸乙酯提取物在病理狀態(tài)下對(duì)腸道L細(xì)胞GLP-1表達(dá)與分泌的影響及其分子機(jī)制
　　棕櫚酸處理NCI-H716細(xì)胞可明顯減少細(xì)胞上清液中GLP-1含量，同時(shí)減少cAMP含量，抑制PKA磷酸化，以及減少核內(nèi)β-catenin水平，造成胞漿內(nèi)β-catenin聚集，但對(duì)胰島素受體信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IRS-1和Akt的磷酸化無(wú)

13、明顯影響。ACE可明顯增加上清液中GLP-1含量，并增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，伴隨著下游激酶PKA磷酸化水平和NCI-H716細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白水平的升高，提示其發(fā)生核轉(zhuǎn)位。ACE對(duì)胰島素受體信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白IRS-1和Akt的磷酸化水平無(wú)明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　水菖蒲抗糖尿病有效提取部位乙酸乙酯提取物(ACE)在體內(nèi)外均具有促進(jìn)GLP-1表達(dá)與分泌的作用，其作用機(jī)制與cAMP/PKA信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路密切相關(guān)。

14、
　　(1)在體內(nèi)，ACE可降低鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)高血糖小鼠、db/db高血糖小鼠、飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠的禁食血糖，并能改善DIO小鼠的隨機(jī)血糖和口服糖耐量。同時(shí)可增加STZ、db/db、DIO小鼠血漿胰島素水平，對(duì)胰島組織具有潛在保護(hù)作用，這可能與其增加腸道GLP-1相關(guān)基因gcg和pc3表達(dá)和血漿GLP-1水平有關(guān)。
　　(2)在體外，ACE在基礎(chǔ)狀態(tài)下可促進(jìn)腸道NCI-H716細(xì)胞表達(dá)與分泌GLP-1，其分