煙酰胺單核苷酸對(duì)腦出血和腦梗出血轉(zhuǎn)化的作用和機(jī)制.pdf

1、腦卒中是腦血液循環(huán)障礙引起的急性腦血管病，因?yàn)檠h(huán)障礙的原因不同，可分為缺血性腦卒中(ischemic stroke)和出血性腦卒中(intracerebral hemorrhage，ICH)。
　　缺血性腦卒中又叫腦梗死，約占全部卒中的80％。是由各種原因引起的局部腦組織供血障礙，導(dǎo)致缺血缺氧性的腦組織病變壞死，進(jìn)而造成一系列的神經(jīng)功能損傷的疾病。在缺血性腦卒中的病理發(fā)展過程中，有一種狀態(tài)兼具缺血性腦卒中和出血性腦卒中的特征，即

2、腦缺血出血轉(zhuǎn)化（hemorrhagic transformation，HT），在腦缺血病人中，出血轉(zhuǎn)化和升高的死亡率相關(guān)。缺血性腦卒中急性期的溶栓治療是目前唯一經(jīng)過美國(guó)FDA批準(zhǔn)的治療方法。最常用的溶栓藥物是纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogenactivator，tPA)，其可有效改善患者的生存率和預(yù)后[1]。但由于其可增加出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生率，以及在超過腦梗后4.5小時(shí)使用會(huì)極大地增加出血幾率，溶栓治療方法的使

3、用受到諸多限制。因此，研發(fā)與tPA聯(lián)合使用，以降低其導(dǎo)致的出血性轉(zhuǎn)化，或可延長(zhǎng)其使用時(shí)間窗的藥物具有極大的臨床應(yīng)用潛力。
　　腦出血是致命的卒中類型，有較高的發(fā)病率和死亡率[2]，約占全部卒中的10～15％。有報(bào)道指出，腦出血發(fā)病后一月死亡率約為40％，過去二十年醫(yī)療水平的提高并不能降低該死亡率[3]。腦出血的高復(fù)發(fā)率和致死率的原因是由于缺乏有效的治療選擇，因?yàn)楝F(xiàn)有的臨床治療方法還僅限于初級(jí)治療，如控制顱內(nèi)壓、治療血腫和維持血流動(dòng)

4、力學(xué)穩(wěn)定[2，4]，因此研究有效的治療方法極為重要。
　　煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，簡(jiǎn)稱Nampt，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）合成的限速酶，可調(diào)控NAD的濃度。本課題組在小鼠腦缺血模型上的研究發(fā)現(xiàn)，Nampt可以通過控制NAD的合成來調(diào)控SIRT1的去乙?；芰?，進(jìn)一步調(diào)節(jié)AMPK的上游激酶LKB1的乙?；图?xì)胞內(nèi)的重分布，最終調(diào)節(jié)AMPK活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn):Nampt酶產(chǎn)物

5、煙酰胺單核苷酸，即NMN可以通過腦室給藥在大鼠線栓法大腦中動(dòng)脈堵塞模型(MCAO)中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善動(dòng)物神經(jīng)學(xué)功能。主要包括:腦梗體積縮小、神經(jīng)功能缺陷減輕、半影區(qū)細(xì)胞死亡減少[6]。在線栓法MCAO再灌注小鼠模型上，NMN腹腔注射(500mg/Kg)，每天1次，連續(xù)給藥1周以上，可顯著降低腦卒中死亡率，促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)再生、功能恢復(fù)[7]。
　　本課題利用不同的動(dòng)物模型和更貼近臨床的給藥方法進(jìn)一步驗(yàn)證了NMN在缺血性腦卒中

6、中的作用。構(gòu)建了腦梗出血轉(zhuǎn)化模型和腦出血模型，并探索NMN在這兩種模型中的作用和機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、在腦梗和腦梗出血轉(zhuǎn)化模型研究中用到的方法
　　1.利用電擊凝斷大腦中動(dòng)脈，構(gòu)建電凝法MCAO模型;
　　2.栓線經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，堵塞大腦中動(dòng)脈，構(gòu)建線栓法MCAO模型;
　　3.利用TTC染色，連續(xù)切片法計(jì)算腦梗死體積;
　　4.在pMCAO模型中，梗死后5h給tPA，誘導(dǎo)腦梗出血轉(zhuǎn)化;

7、r>　　5.利用QuantiChromTM Hemoglobin Assay Kit檢測(cè)腦組織血紅蛋白含量。
　　二、在腦出血模型的研究中用到的方法
　　1.利用腦立體定位技術(shù)，向紋狀體注射0.05U膠原酶IV，誘導(dǎo)腦出血模型;
　　2.利用平衡木實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能;
　　3.利用連續(xù)切片法，計(jì)算血腫體積;
　　4.利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)炎癥因子mRNA水平;
　　5.利用免疫組織

8、化學(xué)染色的方法檢測(cè)炎癥因子、趨化因子和NOX1的表達(dá)，以及炎性細(xì)胞的活化;
　　6.利用TUNEL染色技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡情況;
　　7.通過檢測(cè)MDA、H2O2、CuZn/Mn-SOD和ABTS活性，評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.NMN靜脈給藥可降低電凝法MCAO大鼠腦梗死體積。
　　2.NMN預(yù)給藥或急性期給藥可降低線栓法MCAO小鼠腦梗死體積。
　　3.NMN毒性測(cè)試顯示其無明顯的急性

9、毒性。
　　4.成功構(gòu)建了腦梗出血轉(zhuǎn)化模型。
　　5.NMN靜脈給藥可減少腦梗后自發(fā)性出血轉(zhuǎn)化和tPA誘導(dǎo)的出血轉(zhuǎn)化。
　　6.成功構(gòu)建了膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型(cICH)。
　　7.NMN急性期靜脈給藥可改善腦出血后小鼠神經(jīng)功能。
　　8.NMN急性期靜脈給藥可緩解出血損傷誘導(dǎo)的腦組織水腫
　　9.NMN急性期靜脈給藥可下調(diào)血腫及周圍組織炎癥因子(TNF-a、IL-6)和趨化因子(I cam-1)的

10、表達(dá)。
　　10.NMN急性期靜脈給藥可下調(diào)血腫及周圍組織小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　11.NMN急性期靜脈給藥可減少血腫周圍組織細(xì)胞死亡。
　　12.NMN急性期靜脈給藥可降低血腫周圍組織脂質(zhì)氧化活性和過氧化氫活性，下調(diào)NOX1的表達(dá)。
　　13.NMN長(zhǎng)期給藥可促進(jìn)腦出血模型小鼠神經(jīng)功能和體重的恢復(fù)。
　　綜上所述，本課題成功構(gòu)建了腦梗出血轉(zhuǎn)化和腦出血模型，并發(fā)現(xiàn)了NMN在缺血性腦卒中模型