硫化氫改善高血壓動脈血管內(nèi)皮功能紊亂的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分硫化氫激活 PPARδ/eNOS通路改善高血壓患者腎動脈內(nèi)皮依賴的舒張功能
　　目的：硫化氫（H2S）被證實為第三種氣體信號分子，其作為氣體調(diào)質(zhì)在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，具有改善血管內(nèi)皮功能紊亂的作用，但是其保護(hù)內(nèi)皮作用的機(jī)制目前還遠(yuǎn)未闡明清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體δ（peroxisome proliferators-activated receptorδ，PPARδ）作為核受體家族的一員，在代謝方面發(fā)揮的作用已經(jīng)為

2、大家所熟知。最近的研究發(fā)現(xiàn)， PPARδ能夠通過激活eNOS/NO通路增強(qiáng)內(nèi)皮依賴的舒張功能。因此，我們提出假設(shè)認(rèn)為H2S通過激活PPARδ/eNOS通路發(fā)揮改善內(nèi)皮的作用。本研究選取高血壓患者和血壓正?；颊叩哪I動脈，旨在探討H2S對PPARδ/eNOS通路的影響，以及是否通過該通路改善高血壓患者的內(nèi)皮舒張功能紊亂。
　　方法：本實驗選取罹患高血壓或血壓正常并行腎切除患者的腎動脈。高血壓患者的入選標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓≥140 mmHg或舒

3、張壓≥90 mmHg，不合并糖尿病。入選患者均已簽署知情同意書。高血壓組和血壓正常組的年齡無差異（64.00±2.892歲 vs59.92±2.058歲）。高血壓組和正常血壓組的腎動脈在加入或不加入硫氫化鈉（NaHS，50μmol/ L）的情況下，置于完全DMEM培養(yǎng)基中37℃孵育12 h。孵育后，取腎動脈在器官浴槽中檢測乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。利用Western blot檢測血管緊張

4、素受體1（AngiotensinⅡ receptor1，AT1）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathioneγlyase，CSE）、PPARδ、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮和酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）、p-Akt和p-AMPK等相關(guān)蛋白的表達(dá)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過AngII處理后，觀察H2S以及各種工具藥對一氧化氮（nitric oxide, NO）生成量

5、的影響。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡，檢測NO探針的熒光強(qiáng)度來反映NO含量。
　　結(jié)果：
　　1高血壓組腎動脈對 ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)性較血壓正常組腎動脈明顯下降。NaHS慢性孵育高血壓患者腎動脈可改善內(nèi)皮依賴性舒張功能。
　　2高血壓組患者的腎動脈 AT1蛋白表達(dá)水平顯著升高， CSE蛋白表達(dá)水平下降。NaHS慢性孵育可下調(diào)高血壓患者腎動脈AT1受體表達(dá)，增加CSE蛋白水平。
　　3高血壓組患者腎動脈 PP

6、ARδ蛋白表達(dá)下調(diào)，p-eNOS表達(dá)水平降低。NaHS慢性孵育可上調(diào)高血壓患者腎動脈PPARδ受體表達(dá)，提高p-eNOS表達(dá)水平。
　　4 NaHS慢性孵育可增加高血壓患者腎動脈 p-Akt和 p-AMPK蛋白表達(dá)水平。
　　5在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中， NaHS可增加血管緊張素 II（angiotensinII，AngII）處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成量。NaHS促進(jìn) NO生成的作用可被 GSK0660（1μmol/L

7、, PPARδ受體阻斷劑）、LY294002（5μmol/L, PI3k抑制劑）、Wortmanin（0.1μmol/L, PI3k抑制劑）和 compound C(10μmol/L, AMPKα抑制劑)部分阻斷。而應(yīng)用AT1受體的阻斷劑可發(fā)揮與NaHS相似的作用。
　　結(jié)論：H2S可改善高血壓患者內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能，其改善內(nèi)皮功能的作用可能與改善血管內(nèi)源性 CSE和 AT1的失衡，以及激活PPARδ/eNOS通路有關(guān)。PI

8、3K/Akt和AMPK信號通路可能參與了H2S激活PPARδ/eNOS通路的作用。
　　第二部分硫化氫激活PPARδ改善腎血管性高血壓大鼠腎動脈內(nèi)皮依賴的舒張功能
　　目的：大鼠腎血管性高血壓模型是基礎(chǔ)研究中常用的高血壓模型之一。腎血管性高血壓時腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system, RAS）的過度激活，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損。本部分研究利用大鼠腎血管性高血壓模型，進(jìn)一步證實H2S通過激活PP

9、ARδ通路，改善高血壓時動脈內(nèi)皮以來的舒張功能，并探討其激活PPARδ的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：本實驗選用健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，7周齡，190-200克，隨機(jī)分為四組：Sham組、Sham+NaHS組、2K1C組和2K1C+NaHS組。2K1C和2K1C+NaHS組大鼠行兩腎一夾手術(shù)制備腎血管性高血壓模型。Sham+NaHS和2K1C+NaHS組大鼠于兩腎一夾手術(shù)或假手術(shù)后第三周開始腹腔注射NaHS（

10、56μmol/kg），其余兩組于相同時間點腹腔注射生理鹽水。每4周通過鼠尾動脈測量動物血壓。第20周末利用小動物超聲檢測腎動脈血流量；各組動物取腎動脈行微血管張力測定，觀察內(nèi)皮和非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，并且應(yīng)用PPARδ受體阻斷劑GSK0660（1μmol/L）、激動劑GW0742（0.1μmol/L）、AMPKα磷酸化抑制劑（Compound C10μmol/L）、PI3k的抑制劑LY294002（5μmol/L）和Wortmani

11、n（0.1μmol/L）以及NO合酶的抑制劑L-NAME（100μmol/L），通過慢性孵育2K1C組和2K1C+NaHS組大鼠腎動脈觀察上述阻斷劑對NaHS作用的影響。利用高壓液相質(zhì)譜法測定血漿中H2S含量；利用硝酸鹽還原酶法測定血漿中NO含量；HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化；利用Western blot檢測PPARδ、CSE、p-eNOS、p-Akt和p-AMPK等蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1四組大鼠一般情況監(jiān)測結(jié)果

12、顯示：2K1C組和2K1C+NaHS組大鼠體重在術(shù)后12周開始出現(xiàn)增長緩慢，并一直持續(xù)至實驗結(jié)束。四組動物的進(jìn)食量和飲水量無差異，2K1C組的尿量較其他三組動物顯著升高。
　　2慢性外源性給予NaHS可顯著降低2K1C大鼠的平均動脈壓和血漿中AngII水平以及腎動脈AT1受體蛋白表達(dá)水平。
　　3慢性外源性給予NaHS可顯著降低2K1C大鼠左右腎臟重量比、改善腎功能、減輕腎實質(zhì)形態(tài)學(xué)損傷。
　　4慢性外源性給予NaHS

13、可顯著增加2K1C大鼠未鉗夾側(cè)腎血流量。
　　5慢性外源性給予NaHS可顯著改善2K1C大鼠內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能，而對非內(nèi)皮依賴性的舒張功能無顯著影響
　　6慢性外源性給予NaHS可顯著升高血漿H2S和NO含量，上調(diào)腎動脈CSE蛋白表達(dá)水平。
　　7慢性外源性給予NaHS可顯著上調(diào)2K1C大鼠腎動脈PPARδ和p-eNOS的蛋白表達(dá)水平。
　　8慢性外源性給予NaHS可顯著上調(diào)2K1C大鼠腎動脈p-Akt和p

14、-AMPK的蛋白表達(dá)水平。
　　9應(yīng)用PPARδ受體阻斷劑、激動劑，AMPKα磷酸化抑制劑，PI3k的抑制劑，NO合酶的抑制劑，通過慢性孵育2K1C組和2K1C+NaHS組大鼠腎動脈，發(fā)現(xiàn)上述阻斷劑可部分或全部阻斷NaHS的作用。
　　結(jié)論：H2S可改善高血壓患者內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能，其改善內(nèi)皮功能的作用可能與改善血管內(nèi)源性CSE和AT1的失衡，以及激活PPARδ/eNOS通路有關(guān)。PI3K/Akt和AMPK信號通路可能

15、參與了H2S激活PPARδ/eNOS通路，并進(jìn)而改善高血壓動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的作用。
　　第三部分硫化氫通過下調(diào) BMP4/COX2的表達(dá)改善腎血管性高血壓大鼠腎動脈內(nèi)皮依賴的收縮功能
　　目的：高血壓時，內(nèi)皮功能紊亂一方面表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴的血管舒張功能降低，另一方面表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴的血管收縮功能增強(qiáng)。骨形成蛋白4（ Bone morphogenic protein4，BMP4）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transformin

16、g growth factor-β，TGF-β）超家族，主要調(diào)節(jié)骨骼的胚胎發(fā)育和再生修復(fù)。最近研究發(fā)現(xiàn)，BMP4在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。BMP4通過增加NADPH氧化酶的表達(dá)和活性，促進(jìn)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）過度生成，進(jìn)而增加環(huán)氧酶2（cyclooxygenase2，COX2）活性，導(dǎo)致前列腺素類物質(zhì)生成和釋放增多，從而損傷血管內(nèi)皮，增強(qiáng)血管內(nèi)皮依賴的收縮功能，最終促進(jìn)高血壓形成。已有

17、研究顯示，BMP4/COX2表達(dá)增加與自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮依賴性的血管收縮功能增強(qiáng)有關(guān)。本研究利用2K1C制備的高血壓大鼠模型，旨在觀察H2S改善高血壓大鼠內(nèi)皮依賴的血管收縮功能，并觀察H2S對BMP4/COX2表達(dá)的影響。
　　方法：健康雄性SD大鼠，7周齡，190-200克，隨機(jī)分為四組：Sham組、Sham+NaHS組、2K1C組和2K1C+NaHS組。2K1C和2K1C+NaHS組大鼠行兩腎一夾手術(shù)制備腎血管性高血壓模型。

18、Sham+NaHS和2K1C+NaHS組大鼠于兩腎一夾手術(shù)或假手術(shù)后第三周開始腹腔注射NaHS（56μmol/kg），其余兩組于相同時間點腹腔注射生理鹽水。開始應(yīng)用NaHS后每4周通過鼠尾動脈測量動物血壓；第20周末各組動物取腎動脈行微血管張力的測定，觀察血管內(nèi)皮依賴性的收縮功能；利用高壓液相質(zhì)譜法測定血漿中 H2S的含量；利用 Western blot檢測 CSE、AT1、BMP4、COX2以及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；利用試劑盒檢

19、測SOD活性和MDA含量。
　　結(jié)果：
　　12K1C高血壓大鼠慢性給予NaHS處理，可顯著降低大鼠動脈血壓，上調(diào)CSE蛋白表達(dá)，增加血漿中H2S含量。
　　22K1C大鼠腎動脈內(nèi)皮依賴性收縮功能顯著增強(qiáng)。外源性給予NaHS可改善高血壓大鼠內(nèi)皮依賴性血管收縮功能。
　　3外源性給予 NaHS可顯著下調(diào)腎血管性高血壓大鼠腎動脈中 AT1受體和BMP4的蛋白表達(dá)。
　　4外源性給予 NaHS可顯著降低腎血管性高