生存素(Survivin)過表達(dá)對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性及血管生成能力的影響.pdf

1、外周動脈疾?。╬eriphery artery disease, PAD)包括一系列由供應(yīng)腦部、內(nèi)臟器官和肢體的動脈結(jié)構(gòu)和功能改變而導(dǎo)致的非冠狀動脈系統(tǒng)綜合征，即指除冠狀動脈之外的主動脈及其分支動脈的狹窄、閉塞或瘤樣擴(kuò)增疾病，以下肢動脈硬化閉塞最為常見。目前手術(shù)和藥物均無法逆轉(zhuǎn)動脈壁本身的病變。治療 PAD的關(guān)鍵為血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascula Endothelial Cells, VECs），其激活、增殖、遷移、管腔結(jié)構(gòu)的形成以及塑形，

2、以出芽的方式形成新的血管并重建形成新生血管網(wǎng)，可增加末梢循環(huán)血量或改善微循環(huán)血液灌注，同時可解決外科血管重建術(shù)后動脈長期通暢率的問題。然而，成熟的 VECs的活性低，生長速度及自我更新速度慢。VECs降解細(xì)胞外基質(zhì)和遷移能力弱，導(dǎo)致側(cè)枝循環(huán)建立不良，綜上獲得一種耐凋亡、促增殖，同時具備強(qiáng)大的遷移能力和降解細(xì)胞外基質(zhì)的理想VECs是治療PAD的關(guān)鍵所在。
　　存活素（survivin，SVV）由142個氨基酸組成，為IAP（inhi

3、bitor of apoptosis protein)家族中分子量最小的成員,在腫瘤細(xì)胞中其強(qiáng)大的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和抗凋亡能力得到了大量研究證實(shí)。SVV是目前已知最強(qiáng)的凋亡抑制因子[1]，可通過抑制Caspase-3,Caspase-9,Caspase-10等凋亡通路中的多個環(huán)節(jié)來抑制細(xì)胞的凋亡，同時參與不同細(xì)胞周期的調(diào)控，并與多種周期調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，包括CyclinD,CyclinE等，近年來已有很多研究證實(shí)SVV也

4、表達(dá)于非腫瘤細(xì)胞，如胃粘膜[2]、巨噬細(xì)胞[3]以及腎小管上皮細(xì)胞等[4]，且SVV并非腫瘤的特異基因，表達(dá)后細(xì)胞不會產(chǎn)生腫瘤樣轉(zhuǎn)化。
　　因此本研究培養(yǎng)大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)其 Survivin基因的表達(dá)，以獲得抗凋亡，促增殖的理想血管內(nèi)皮細(xì)胞，并從整體水平探討Survivin基因促進(jìn)VECs增殖及抗凋亡的機(jī)制以及對體內(nèi)血管生成的影響，為PAD的治療提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分 Survivin在大鼠血管內(nèi)皮細(xì)

5、胞的表達(dá)
　　目的：探討Survivin在大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)
　　方法：采用真核細(xì)胞裂解將正常長至90％左右的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞裂解，并按照說明提取相應(yīng)蛋白質(zhì)，通過western-blot方法檢測正常大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin表達(dá)狀況。
　　結(jié)果：在正常培養(yǎng)的原代大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Survivin表達(dá)率高達(dá)100%，western-blot結(jié)果顯示，在幾組正常的 RAEC中，條帶顯色較弱，灰度均值達(dá)13.

6、48。
　　結(jié)論：在正常大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin均有較低的表達(dá)。
　　第二部分?jǐn)y帶針對大鼠Survivin基因的腺病毒的轉(zhuǎn)染及對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物特性的影響及其機(jī)制的研究
　　目的：研究 Survivin基因?qū)Υ笫笱軆?nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及血管生成的影響。
　　方法:擴(kuò)增、純化過表達(dá)大鼠Survivin基因重組腺病毒，利用RT-qPCR、Western-blot檢測對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的感染及基因過表

7、達(dá)效果。針對過表達(dá) Survivin基因后的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀、CCK-8等，檢測 Survivin基因在體外對細(xì)胞凋亡、增殖、周期的影響。采用Western-blot檢測在凋亡和周期通路中與Survivin相互作用的凋亡蛋白Caspase-3、bcl-2和周期蛋白CyclinD。將過表達(dá)SVV的RAEC采用肌肉注射的方法種植于裸鼠體內(nèi)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對CD31表達(dá)陽性的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行檢查。
　　結(jié)果：增

8、殖型腺病毒在MOI為300時，轉(zhuǎn)染率為95%，并具有很明顯的基因過表達(dá)作用。Survivin過表達(dá)后，上調(diào)了bcl-2表達(dá)、下調(diào)了Caspase-3從而失活或抑制了其介導(dǎo)的凋亡通路，凋亡率明顯降低；同時，Survivin促進(jìn)了CyclinD的表達(dá)，說明SVV可能同時參與了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的調(diào)控，通過細(xì)胞周期蛋白 CyclinD等使細(xì)胞加速從G1期到S期的轉(zhuǎn)化。細(xì)胞移植2周以后，肌肉種植處免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示有明顯的新生血管產(chǎn)生，說明