TR3 LBD的分子機(jī)理和結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、第一章核受體與核孤兒受體TR3概述
　　 核受體是一類進(jìn)化上相關(guān)的、具有共同結(jié)構(gòu)特征、能夠與DNA特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。它們能以單體、同源二聚體或者異源二聚體的形式結(jié)合到相應(yīng)的激素應(yīng)答元件上，對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、存活和凋亡以及維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。由于其功能重要而復(fù)雜，很多核受體與諸如癌癥、糖尿病、老年癡呆、心血管疾病、不育癥和激素抵抗綜合征等多種疾病有著密切關(guān)系，因此核受體

2、也成為了藥物研發(fā)的重要標(biāo)靶。經(jīng)典核受體轉(zhuǎn)錄激活功能受配體的調(diào)節(jié)，因此尋找和研究核受體的配體，對(duì)靶向核受體的藥物的研發(fā)具有重要意義。
　　 TR3（也稱Nur77、NGFI-B、N10和NAK1）是由立早基因(immediate-early genes) NR4A1編碼的孤兒受體，是核受體超家族的重要成員之一。它在結(jié)構(gòu)上具有核受體的典型特征，但其內(nèi)源性配體至今尚未被發(fā)現(xiàn)，因此也被稱為核孤兒受體（orphan nuclear rec

3、eptor）。TR3能夠以細(xì)胞特異的方式在各種不同外界信號(hào)(如血清、生長(zhǎng)因子、炎癥因子、內(nèi)分泌素、抗原受體連接(antigen receptor ligation)以及凋亡刺激）的誘導(dǎo)下迅速表達(dá)，并在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、能量代謝、炎癥反應(yīng)血管再生等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。作為轉(zhuǎn)錄因子，TR3以單體、同源二聚體和異源二聚體與不同的應(yīng)答元件NBRE、NurRE或DR5結(jié)合，調(diào)控許多基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與調(diào)控許多生命過(guò)程;TR3還能夠出核轉(zhuǎn)

4、定位于線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，TR3還能夠作為調(diào)控蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)影響其他蛋白的生物學(xué)功能。
　　 本章節(jié)對(duì)核受體超家族和孤兒受體TR3的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和生物學(xué)功能及藥物開(kāi)發(fā)或配體研究情況進(jìn)行了綜述。
　　 第二章生物大分子X(jué)射線晶體學(xué)
　　 結(jié)構(gòu)生物學(xué)通過(guò)研究生物大分子（尤其是蛋白和核酸分子）、大分子復(fù)合物或組裝體的結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，來(lái)揭示生命現(xiàn)象的物理和化學(xué)本質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)展成熟的

5、研究生物大分子結(jié)構(gòu)的方法有多種，其中X射線晶體學(xué)、核磁共振技術(shù)(NMR)和冷凍電鏡(cryo-(EM)三維重構(gòu)是當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究手段。這三種方法各有獨(dú)到之處，又有局限和不足。作為最早發(fā)展起來(lái)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究手段，X射線晶體學(xué)以其分辨率高，原子坐標(biāo)精確，不受蛋白大小限制等優(yōu)點(diǎn)成為目前解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要手段。目前PDB(Protein Data Bank)中收錄的蛋白結(jié)構(gòu)中有大約85％是利用X射線晶體學(xué)的方法獲得的。
　　

6、 本章對(duì)本論文重點(diǎn)使用的技術(shù)手段——X射線晶體學(xué)進(jìn)行以下幾方面的介紹:蛋白晶體的培養(yǎng)、衍射數(shù)據(jù)的收集處理、X射線晶體學(xué)的基本原理、相位獲取的方法原理、模型構(gòu)建及修正等。對(duì)于本論文采用的分子置換法解相角的原理和相關(guān)軟件我們做重點(diǎn)介紹。
　　 第三章小分子拮抗劑TMPA靶向TR3 LBD的結(jié)構(gòu)研究
　　 TR3 LBD缺乏典型的配體結(jié)合口袋(LBP)及共激活因子結(jié)合位點(diǎn)。最近發(fā)現(xiàn)小分子化合物Cytosporone B(Csn

7、-B)能夠結(jié)合TR3的LBD激活TR3下游基因的轉(zhuǎn)錄。如今，吳喬實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)Csn-B的一種衍生物TMPA(ethyl2-[2，3，4trimethoxy-6(1-octanoyl) phenyl] acetate)可以通過(guò)結(jié)合TR3 LBD來(lái)阻斷TR3與LKB1的相互作用，從而激活A(yù)MPK信號(hào)通路，影響糖代謝。為了證明TMPA能夠直接結(jié)合TR3 LBD影響LKB1-AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，我們與吳喬實(shí)驗(yàn)室合作，對(duì)TMPA與TR3 LBD的復(fù)

8、合物結(jié)構(gòu)展開(kāi)了研究。通過(guò)本章研究，我們獲得了2.06(A)的TR3 LBD晶體結(jié)構(gòu)和2.22(A)的TMPA-TR3 LBD復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)結(jié)構(gòu)對(duì)比發(fā)現(xiàn)TMPA的結(jié)合并不改變TR3 LBD的構(gòu)象;TMPA在TR3 LBD上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Site A和Site B，這兩個(gè)位點(diǎn)都不是深埋于LBD內(nèi)部的典型配體結(jié)合口袋，而是LBD分子表面的兩個(gè)淺縫;對(duì)基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的突變體進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Site A的C566對(duì)于TMPA的結(jié)合至關(guān)重要，而

9、T595對(duì)于LKB1的相互作用很重要。說(shuō)明Site A在LKB1結(jié)合位點(diǎn)附近，TMPA結(jié)合到SiteA上能夠阻斷LBD1的結(jié)合。
　　 通過(guò)本章的研究，不僅從結(jié)構(gòu)角度證明了TMPA能夠結(jié)合TR3 LBD，并且闡明了TMPA與TR3 LBD的作用位點(diǎn)及其影響LKB1結(jié)合TR3 LBD的作用機(jī)制。更為今后以TMPA為藥物前體，進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)靶向TR3 LBD治療糖尿病的藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　 第四章核孤兒受體T

10、R3 LBD結(jié)構(gòu)域的二聚化研究
　　 TR3家族受體能夠以單體、同源二聚體、家族內(nèi)異源二聚體的形式調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，TR3還能夠與RXR異源二聚化結(jié)合相應(yīng)應(yīng)答元件。核受體的經(jīng)典二聚化位點(diǎn)為H9-H10區(qū)域，體內(nèi)研究顯示Nurr1（TR3家族的另一個(gè)成員）與RXR的二聚化與I-box（位于H10C端）有關(guān)但不能排除還有其他I-box以外的二聚化位點(diǎn)。本章首先對(duì)TR3家族LBD的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)TR3家族LBD晶體中都

11、不存在H9-H10區(qū)域的分子間相互作用，這與其他大部分核受體不同。我們的晶體結(jié)構(gòu)中TR3 LBD以H11-H12疏水面發(fā)生二聚化，軟件分析該二聚化界面面積為592(A)2，具有特異性，并且TR3家族成員的LBD晶體結(jié)構(gòu)中都存在此相互作用面。X射線小角散射實(shí)驗(yàn)、凝膠過(guò)濾層析及分析性超速離心證明TR3 LBD在溶液狀態(tài)下主要以單體形式存在，少量為二聚體及多聚體。低pH值有利于LBD二聚體的穩(wěn)定，這與我們?cè)诘蚿H值條件下才能獲得衍射能力強(qiáng)的T