基底硬度對肝細(xì)胞胞間粘附復(fù)合物穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過比較分析不同硬度基底上的融合生長肝細(xì)胞（L02）的差異，探查細(xì)胞間粘附復(fù)合物穩(wěn)定性不同的成因，加深微觀力學(xué)環(huán)境改變對細(xì)胞群體生長行為及其表型影響的進(jìn)一步認(rèn)識。
　　方法：構(gòu)建細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，制備聚乙烯醇水凝膠基底膜，硬度分別為3.6kPa、10kPa、30kPa。分別對應(yīng)正常的肝組織、纖維化中期的肝組織和纖維化末期的肝組織的硬度。運(yùn)用實(shí)時(shí)顯微拍攝觀察在不同硬度基底上L02細(xì)胞的形態(tài)特征；應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測不同硬度

2、基底上的細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架構(gòu)象、β-連環(huán)蛋白和vinculin表達(dá)分布；采用Western Blotting方法檢測不同硬度基底的細(xì)胞膜上β-連環(huán)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)中vinculin的表達(dá)和β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平。
　　結(jié)果：基底硬度對L02細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響。（1）融合生長的L02細(xì)胞呈圓形或多邊形，隨基底硬度增加，L02細(xì)胞的球形指數(shù)增大。（2）采用EDTA處理匯合生長的L02細(xì)胞，細(xì)胞逐漸分離，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)現(xiàn)為細(xì)胞逐

3、漸變圓，鋪展面積和細(xì)胞周長逐漸縮小。隨著硬度增大，L02細(xì)胞從融合狀態(tài)到細(xì)胞-細(xì)胞間連接被破壞所需的時(shí)間依次變短。（3）融合生長的L02細(xì)胞在軟基質(zhì)上肌動(dòng)蛋白微絲裝配成皮質(zhì)下環(huán)，β-連環(huán)蛋白集中分布于細(xì)胞間連接處。隨著基底硬度增大，肌動(dòng)蛋白骨架環(huán)削弱，并在胞質(zhì)內(nèi)形成絲狀纖維，β-連環(huán)蛋白彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中。（4）隨基底硬度增大，融合生長的L02細(xì)胞膜上β-連環(huán)蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），細(xì)胞質(zhì)中vinculin和p-β-連環(huán)蛋白(

4、Tyr654)的表達(dá)量顯著增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：（1）基底硬度影響肝細(xì)胞胞間粘附復(fù)合物穩(wěn)定性，基底硬度越大，復(fù)合物穩(wěn)定性越差。（2）細(xì)胞連接關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白與黏著斑輔助蛋白vinculin的分布和表達(dá)受基底硬度影響，兩者隨基底硬度變化趨勢顯示，基底硬度與細(xì)胞間粘附復(fù)合物裝配成負(fù)相關(guān)，與黏著斑裝配成正相關(guān)。細(xì)胞間粘附作用與細(xì)胞-基底粘附作用存在競爭關(guān)系。（3）肌動(dòng)蛋白骨架微絲構(gòu)型受基底硬度調(diào)控，其作為細(xì)胞力學(xué)作用的主