3-D打印支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細胞修復(fù)脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：脊髓損傷（spinalcordinjury，SCI）是一種高致殘率、后果嚴重的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來隨著交通業(yè)、建筑業(yè)的不斷發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率也在不斷上升。脊髓損傷造成的感覺運動功能障礙往往是永久性的，給患者和家庭帶來巨大的經(jīng)濟和心理負擔。因此對脊髓損傷的研究和治療是醫(yī)學(xué)界迫切要解決的一項重點難題，神經(jīng)科學(xué)界一直在探索各種方法來提高SCI的治療效果。大量基礎(chǔ)實驗研究證實組織工程學(xué)在SCI治療中有著廣闊的應(yīng)用前景，組織工

2、程學(xué)治療SCI的基本模式是生物支架+種子細胞。本實驗運用3-D打印機制備仿生支架，研究神經(jīng)分化因子1（neuronaldifferentiation1，NeuroD1）過表達對神經(jīng)干細胞（neuralstemcells，NSCs）生存和分化的影響，探討3-D仿生支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細胞對大鼠脊髓損傷修復(fù)的療效。
　　方法：
　　1、取孕14d的SD（SpragueDawley）大鼠，麻醉消毒后分離胎鼠大腦海馬組織

3、，研磨并胰酶消化后離心，計數(shù)后分瓶培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細胞生長情況。當神經(jīng)球直徑100-150μm時，胰酶消化后計數(shù)傳代培養(yǎng)。取第三代神經(jīng)干細胞行Nestin和DAPI免疫熒光染色鑒定其純度。將第三代神經(jīng)干細胞消化計數(shù)后種植于預(yù)鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，7d后行MAP2、GFAP、MBP免疫熒光染色鑒定其分化潛能。取孕14dSD大鼠的胎鼠腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，進行NSCs的鑒定和分化研究。
　　2、攜帶NeuroD1基因

4、的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染神經(jīng)干細胞，并研究其對神經(jīng)干細胞生存和分化的影響。
　　3、制備硫酸肝素-膠原蛋白水凝膠，采用3-D打印仿生脊髓支架，掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)，測量孔隙率，并模擬體液體外降解實驗測量pH值和質(zhì)量變化。實驗分為2組，A組取仿生脊髓支架體外與NSCs共培養(yǎng)，B組直接將細胞懸液接種于預(yù)涂左旋多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板上。采用光鏡和掃描電鏡觀察細胞黏附與形態(tài)變化，MTT檢測細胞活力，免疫熒光染色鑒定NSCs的分化情況。
　　

5、4、3-D打印支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細胞修復(fù)脊髓損傷的實驗研究。本實驗分四組，分別為對照組，支架組，支架+NSCs-GFP組，支架+NSCs-NeuroD1組。于1w、2w、4w、6w、8w分別進行在體和離體實驗評估：功能學(xué)恢復(fù)評估和形態(tài)學(xué)恢復(fù)評估。
　　結(jié)果：
　　1、顯微鏡下可見神經(jīng)干細胞生長良好，增殖迅速，7d左右可形成直徑150μm左右的神經(jīng)球，細胞透光度好。第三代神經(jīng)干細胞經(jīng)免疫熒光染色，Nestin和D

6、API雙標率95％以上。分化鑒定試驗可見MAP2、GFAP和MBP陽性細胞，可與DAPI雙標。
　　2、熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染細胞發(fā)綠光，GFP轉(zhuǎn)染成功。PCR結(jié)果顯示NeuroD1mRNA在NSCs-NeuroD1組表達最高，與其它兩組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。PCR結(jié)果顯示MAP2mRNA在NSCs-NeuroD1組表達最高，與其它兩組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。NSCs-NeuroD1組與其它兩組相比，神經(jīng)元突起長度明顯增

7、加，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。MTT結(jié)果顯示NSCs-NeuroD1組細胞增殖水平與其它兩組相比有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　3、3-D打印機成功制備出膠原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架，掃描電鏡顯示內(nèi)部具有縱行排列、平行的微孔結(jié)構(gòu)，通過排水法計算孔隙率為90%；體外降解實驗中，支架pH值未發(fā)生明顯變化，8周左右支架降解完全，符合組織工程支架要求。MTT檢測示兩組培養(yǎng)1、3、7dA值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P

8、<0.05）；光鏡觀察兩組均可見大量神經(jīng)球分化，神經(jīng)纖維交織成網(wǎng)狀；培養(yǎng)7dA組掃描電鏡觀察示細胞黏附于支架上，大量細胞伸出軸突，并且有神經(jīng)球形成；免疫熒光染色示，兩組均可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，定量分析顯示A和B組分化率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、支架+NSCs-NeuroD1組各時間段BBB評分最高，與其它三組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。第八周，Tarlov和Rivlin評分，支架+NSCs-NeuroD1評

9、分最高，與其它三組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。神經(jīng)電生理結(jié)果表明，支架+NSCs-NeuroD1組運動和感覺潛伏期最短與其它三組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；支架+NSCs-NeuroD1組運動和感覺振幅最大，與其它三組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。免疫熒光染色結(jié)果表明，八周時支架+NSCs-NeuroD1組可見GFP陽性細胞，部分分化為神經(jīng)元，與支架+NSCs-GFP組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：

10、
　　1、成功建立胚胎SD大鼠神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)方法，細胞狀態(tài)好、純度高。神經(jīng)干細胞有多樣分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退變性疾病的細胞替代治療提供了實驗基礎(chǔ)。
　　2、過表達NeuroD1可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，能使分化神經(jīng)元突起長度增加，對神經(jīng)干細胞增殖有促進作用。
　　3、仿生3-D膠原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性，能促進NSCs增殖和分化，