基于PTEN信號通路研究丹酚酸A對肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及分子機(jī)制.pdf

1、肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率和發(fā)病率均居癌癥首位。根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，肺癌已成為全世界死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤。目前，肺癌患者的五年生存率不足15％，導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitionEMT)是肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要原因，EMT能通過改變腫瘤細(xì)胞特性和腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境來增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，因此，EM

2、T在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，其具體機(jī)制揭示預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和開發(fā)新抗腫瘤治療靶點(diǎn)藥物均具有重要意義。PTEN(phasphatase and tensin homo-log deleted inchromosome10)是最早發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多種進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性腫瘤（非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、腦癌、前列腺癌等）中發(fā)生高頻率缺失和突變。PTEN信號途徑在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程中發(fā)揮重要的作用

3、，靶向抑制PTEN信號途徑誘導(dǎo)的EMT作為治療腫瘤的一個(gè)新的策略。
　　一、文獻(xiàn)研究
　　查閱相關(guān)古今文獻(xiàn)，從中醫(yī)藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移文獻(xiàn)研究、活血化瘀治則抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究以及丹參和丹酚酸A抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究三個(gè)方面對中醫(yī)藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)行了較為系統(tǒng)的綜述;從腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和PTEN信號通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移研究兩個(gè)方面對現(xiàn)代抗腫瘤轉(zhuǎn)移的信號通路進(jìn)行了深入地探討，為論文制定切實(shí)可行的研究方案，確定研究考察指標(biāo)及研究起點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4、>　　二、實(shí)驗(yàn)研究
　　（一）丹酚酸A對肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響
　　1.丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。以肺癌A549細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用TGF-β1為EMT誘導(dǎo)劑，采用顯微鏡觀察法研究了研究了丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果顯示丹酚酸A能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，細(xì)胞以上皮細(xì)胞形態(tài)為主，少數(shù)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間粘附性增加。提示，丹酚酸A能抑制肺癌發(fā)生EMT的形態(tài)學(xué)改

5、變。
　　2.丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞遷移侵襲的影響。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)Real-time Cell Analysis(RTCA)檢測丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞遷移侵襲的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丹酚酸A能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞遷移(P＜0.05)，且呈時(shí)間依賴性;細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丹酚酸A能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞侵襲(P＜0.05)，且呈時(shí)間依賴性

6、。提示，丹酚酸A能抑制肺癌EMT細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　3.丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)的影響。采用Q-PCR法、免疫熒光高內(nèi)涵法以及western blot法檢測丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。Q-PCR結(jié)果顯示丹酚酸A能顯著增加E-鈣黏蛋白(E-cad)的表達(dá)(P＜0.01)、顯著降低纖維連接蛋白(Fibronectin)(P＜0.01)和波形蛋白(V

7、imentin)(P＜0.01)mRNA水平的表達(dá);免疫熒光高內(nèi)涵法結(jié)合western blot法檢測結(jié)果顯示丹酚酸A能顯著增加E-cad蛋白水平的表達(dá)(P＜0.01)、顯著降低Fibronectin(P＜0.01)和Snail(P＜0.01)蛋白水平的表達(dá)。提示，丹酚酸A能上調(diào)肺癌EMT細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物E-cad mRNA和蛋白水平表達(dá)，下調(diào)肺癌EMT細(xì)胞間質(zhì)表型標(biāo)志物Fibronectin和Vimentin mRNA和蛋白水平表達(dá)

8、，以及下調(diào)負(fù)調(diào)控E-cad蛋白的轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白水平表達(dá)。
　　4.丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞骨架的影響。采用免疫熒光高內(nèi)涵法檢測丹酚酸A對TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌EMT細(xì)胞骨架的影響。結(jié)果顯示，丹酚酸A能顯著降低細(xì)胞骨架微絲條數(shù)(P＜0.01)和細(xì)胞骨架面積(P＜0.01)，并抑制細(xì)胞骨架微絲重排。提示，丹酚酸A能抑制肺癌EMT細(xì)胞骨架重排，從而抑制肺癌發(fā)生EMT。
　?。ǘ腜TEN蛋白和PTEN信

9、號通路研究丹酚酸A影響肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。
　　1.丹酚酸A對肺癌EMT細(xì)胞中PTEN磷酸化水平的影響。采用免疫熒光高內(nèi)涵法結(jié)合納米級超微量蛋白分析系統(tǒng)(Nanopro)檢測丹酚酸A對肺癌EMT細(xì)胞中PTEN磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示，丹酚酸A能顯著上調(diào)肺癌EMT細(xì)胞中PTEN磷酸化水平(P＜0.01)，提示，丹酚酸A可能是通過上調(diào)PTEN磷酸化水平來抑制肺癌EMT的。
　　2.丹酚酸A對肺癌EMT細(xì)胞中PTEN信號

10、通路的影響。采用納米級超微量蛋白分析系統(tǒng)(Nanopro)檢測丹酚酸A對肺癌EMT細(xì)胞中PTEN信號通路的影響。結(jié)果顯示，丹酚酸A能顯著抑制PI3K/AKT信號通路，對FAK/P130cas和SHC/MEK/ERK1/2信號通路抑制作用不顯著。提示，丹酚酸A通過抑制PI3K/AKT信號通路來抑制肺癌EMT，從而抑制肺癌的轉(zhuǎn)移的。
　　3.應(yīng)用PTEN抑制劑BPV和siRNA-PTEN干擾技術(shù)后丹酚酸A對肺癌EMT細(xì)胞侵襲遷移和EM

11、T標(biāo)志物影響。應(yīng)用PTEN抑制劑BPV和siRNA-PTEN干擾技術(shù)檢測結(jié)果顯示PTEN抑制和干擾后，丹酚酸A對肺癌EMT上皮表型標(biāo)志物E-cadherin蛋白上調(diào)能力減弱，且對肺癌EMT細(xì)胞侵襲遷移的能力減弱。提示，丹酚酸A通過上調(diào)PTEN蛋白、抑制PI3K/AKT信號通路抑制肺癌EMT和肺癌細(xì)胞侵襲遷移。
　?。ㄈ┑し铀酇與PTEN蛋白的相互作用、結(jié)合后效應(yīng)以及結(jié)合位點(diǎn)。
　　1.丹酚酸A和PTEN蛋白的相互作用和親和

12、力。采用原核表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)His-PTEN融合蛋白，采用蛋白質(zhì)中壓層析系統(tǒng)純化His-PTEN融合蛋白，采用Octet分子間相互作用儀檢測丹酚酸A和PTEN蛋白的相互作用和親和力。結(jié)果顯示，丹酚酸A與PTEN蛋白有相互作用且親和力較強(qiáng)(KD=7.63×10-7)。提示，丹酚酸A與PTEN蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合。
　　2.丹酚酸A和PTEN結(jié)合后效應(yīng)。采用GENMED-PTEN蛋白磷酸酶活性檢測試劑盒檢測丹酚酸A和PTEN結(jié)合后效應(yīng)

13、。結(jié)果顯示，丹酚酸A與PTEN蛋白結(jié)合后能顯著促進(jìn)PTEN磷酸酶活性(P＜0.05)。提示，丹酚酸A與PTEN蛋白結(jié)合后促進(jìn)PTEN磷酸酶活性，明確了丹酚酸A和PTEN結(jié)合后效應(yīng)。
　　3.丹酚酸A與PTEN蛋白的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。采用GLIDE反向分子對接技術(shù)預(yù)測丹酚酸A與PTEN蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，丹酚酸A可能與PTEN蛋白的S4結(jié)合口袋處結(jié)合，結(jié)合后會減弱C2域?qū)tase域結(jié)合細(xì)胞膜的抑制效應(yīng)，提高PTEN水解產(chǎn)物的產(chǎn)生