人工合成小分子雙鏈RNA通過激活p21基因的表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 外源性和內(nèi)源性小分子dsRNA對膀胱癌細(xì)胞中p21蛋白激活表達(dá)能力的比較
　　目的：人工合成分別與miR-1236-3p、miR-370-5p所作用的p21基因啟動子序列區(qū)域完全互補(bǔ)配對的8對小分子dsRNA: dsP21-242、dsP21-243、dsP21-244、dsP21-245和 dsP21-552、dsP21-553、dsP21-554、dsP21-555，分別觀

2、察其與miR-1236-3p、miR-370-5p在上調(diào)人膀胱癌細(xì)胞系（ T24和 EJ）中抑癌基因p21WAF1/CIP1表達(dá)能力的不同。
　　方法：8對 dsRNA通過參照 saRNA的設(shè)計原則設(shè)計合成。分別轉(zhuǎn)染 dsControl（陰性對照）、miRNA（陽性對照）及對應(yīng)的dsRNA至T24和EJ細(xì)胞，通過qPCR、RT-PCR和Western blot分別檢測p21 mRNA和p21蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果： qPC

3、R檢測顯示 dsP21-245和 dsP21-555均能明顯促進(jìn)兩種細(xì)胞中 p21 mRNA水平的升高；與dsControl組相比，dsP21-245分別促進(jìn)T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)至2.32倍（P<0.01）和2.84倍（P<0.001）；與miR-1236-3p組相比，dsP21-245分別在T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與dsControl組相比，dsP21-555均

4、能明顯促進(jìn)T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA的高表達(dá)（P<0.001，P<0.001）；與miR-370-5p組相比，dsP21-555分別在T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。通過RT-PCR得到了進(jìn)一步驗證。蛋白質(zhì)印跡法提示，在T24和EJ細(xì)胞中，p21蛋白表達(dá)變化與p21 mRNA表達(dá)變化一致。與dsControl組相比，其余6對dsRNA均未能同時顯著上調(diào)兩種細(xì)胞系中p21WAF1/CI

5、P基因的表達(dá)(P>0.05)。
　　結(jié)論：外源性的dsP21-245和dsP21-555能顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞中p21WAF1/CIP1的高表達(dá)，且與相應(yīng)的內(nèi)源性miRNA激活p21WAF1/CIP1表達(dá)的能力無明顯差異。
　　第二部分 外源性dsRNA通過激活p21蛋白的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞生長
　　目的：通過轉(zhuǎn)染外源性dsP21-555至膀胱癌細(xì)胞T24和EJ中，觀察其能否抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。
　　方法：分別轉(zhuǎn)

6、染dsControl（陰性對照組）、miR-370-5p（陽性對照組）和dsP21-555（實驗組）至膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ。通過qPCR檢測p21 mRNA和CDK4/6 mRNA的表達(dá)變化。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測p21蛋白和CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測三組中細(xì)胞周期分布。MTS法檢測三組中細(xì)胞增殖能力。集落形成實驗檢測三組中單個細(xì)胞克隆增殖能力。
　　結(jié)果：qPCR結(jié)果顯示，與陰性對照組dsControl相

7、比，dsP21-555分別促進(jìn)T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)至2.46倍（P<0.01）和2.60倍（P<0.001）；與miR-370-5p相比，T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與陰性對照組dsControl相比，dsP21-555組T24和EJ細(xì)胞中CDK4 mRNA的表達(dá)下調(diào)至0.57倍（P<0.001）和0.46倍（P<0.01），CDK6 mRNA的表達(dá)下調(diào)至0.61倍（P<

8、0.01）和0.64倍（P<0.01）；與 miR-370-5p相比，T24和EJ細(xì)胞中CDK4和CDK6 mRNA表達(dá)的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。蛋白質(zhì)印跡法提示，p21和CDK4及CDK6蛋白表達(dá)變化與相應(yīng)mRNA表達(dá)變化一致。FCM檢測顯示，與陰性對照組 dsControl相比，轉(zhuǎn)染 miR-370-5p或dsP21-555后，處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯上升，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例下降，表明細(xì)胞周期被阻滯

9、在G0/G1期。MTS法顯示，與dsControl相比，轉(zhuǎn)染 miR-370-5p或 dsP21-555后細(xì)胞增殖能力均明顯減弱（ P<0.05），但與miR-370-5p相比，dsP21-555組細(xì)胞增殖能力無明顯變化（P>0.05）。細(xì)胞集落形成實驗顯示，陽對對照組 miR-370-5p和實驗組 dsP21-555形成的集落數(shù)數(shù)量均較陰性對照組dsControl少。
　　結(jié)論：外源性dsP21-555能激活p21蛋白的表達(dá)，具