肝細(xì)胞肝癌SPAG9表達(dá)及其促轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:SPAG9作為支架蛋白參與MAPK信號通路，而ELK1是MAPK信號通路下游重要的效應(yīng)分子之一，參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程。本研究通過檢測肝細(xì)胞肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中SPAG9和ELK1的表達(dá)水平，分析兩者相關(guān)性及其與臨床病理資料的關(guān)系。研究SPAG9干擾對HCC細(xì)胞系HCCLM3和HuH7遷移和侵襲的影響，并探討ELK1表達(dá)在SPAG9調(diào)控的HCC轉(zhuǎn)移中的作用。另外，SPAG9抗體在多種腫瘤高表達(dá)，在肝癌中表達(dá)報道較少。本研究分析探討

2、肝癌患者血清中SPAG9抗體表達(dá)水平及其對肝癌的診斷價值。
　　方法:采用免疫組化法檢測50例HCC患者癌組織及其匹配癌旁組織中SPAG9和ELK1表達(dá)水平，分析SPAG9表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系。用Spearman等級相關(guān)分析SPAG9和ELK1表達(dá)的相關(guān)性。經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測HCCLM3、HuH7、HepG2細(xì)胞系中SPAG9與ELK1表達(dá)。采用ELISA和化學(xué)發(fā)光法定量檢測血清中SPAG9抗體和AF

3、P濃度，用ROC曲線評價SPAG9抗體和AFP的診斷價值。HCCLM3和HuH7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPAG9 siRNA降低SPAG9表達(dá)，RT-PCR和Western blot驗證SPAG9siRNA干擾效果。細(xì)胞劃痕、Transwell法研究SPAG9干擾對HCCLM3和HuH7細(xì)胞遷移和侵襲能力影響。構(gòu)建ELK1過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)ELK1表達(dá)，構(gòu)建ELK1 siRNA下調(diào)ELK1表達(dá)，Transwell法研究HuH7細(xì)胞中ELK1過表達(dá)質(zhì)粒與

4、SPAG9 siRNA共轉(zhuǎn)染，或ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。同時研究SPAG9或ELK1基因表達(dá)改變后，細(xì)胞中SPAG9、ELK1、磷酸化p38表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.在50例肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本中，SPAG9主要表達(dá)定位于胞漿，其中30例(60％)檢測到SPAG9基因高表達(dá)，癌組織表達(dá)顯著高于癌旁組織(P＜0.001)。ELK1在癌組織主要表達(dá)定位于胞核或者胞漿，其中21例(42％)檢測到ELK1在癌

5、組織中高表達(dá)，癌組織表達(dá)顯著高于癌旁組織(P＜0.001)。SPAG9和ELK1在三株HCC細(xì)胞系中表達(dá)情況為HCCLM3和HuH7中表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移能力的HepG2細(xì)胞。經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在50例配對的HCC組織中SPAG9和ELK1表達(dá)正相關(guān)(P＜0.05)。臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)SPAG9表達(dá)與腫瘤TNM分期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(x2=4.585，P=0.032; x2=5.556，P=0.018）。
　　2.PH

6、C組血清SPAG9抗體水平[15.97(8.36～23.84) kIU/L]顯著高于肝炎組[4.98(4.03～6.63) kIU/L，Z=13.83，P＜0.001]、健康對照組[4.96(3.64～8.18) kIU/L，Z=6.896，P＜0.001];但與肝硬化組[19.10(9.40～20.59)k IU/L，Z=0.096，P=0.923]、與轉(zhuǎn)移性肝癌組[50.95(6.07～407.95) kIU/L，Z=0.949，P

7、=0.343]相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.ROC曲線確定SPAG9和AFP的臨界值分別為8.14 kIU/L、14.1μg/L，曲線下面積分別為0.792、0.791，SPAG9抗體、AFP診斷PHC的準(zhǔn)確度分別為78.9％(97/123)、77.2％(95/123)，敏感度分別為87.9％(58/66)、62.1％(41/66)，特異度分別為68.4％(39/57)、94.7％(54/57);兩者聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積為

8、0.860，敏感度和特異度分別為90.9％(60/66)、66.7％(38/57)，準(zhǔn)確度為79.7％(98/123)。8.14 kIU/L為SPAG9診斷臨界值時，6例患者SPAG9抗體表達(dá)均陽性(9.37～27.53 kIU/L)，其中5例組織中SPAG9免疫組化結(jié)果陽性，血清中SPAG9抗體濃度與組織SPAG9表達(dá)高度一致。
　　4.細(xì)胞劃痕，Transwell遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)干擾HCCLM3和HuH7細(xì)胞中SPAG9基因

9、，SPAG9表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。Western和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾SPAG9基因，HCCLM3和HuH7細(xì)胞系中ELK1表達(dá)下調(diào)，Western檢測發(fā)現(xiàn)磷酸化p38表達(dá)下調(diào)。
　　5.ELK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)SPAG9干擾介導(dǎo)的HuH7遷移和侵襲能力的下降，ELK1干擾后HuH7細(xì)胞遷移和侵襲能力下降。
　　結(jié)論:肝細(xì)胞肝癌中SPAG9和ELK1高表達(dá)，SPAG9高表達(dá)與ELK1表