肌萎縮側(cè)索硬化-額顳葉癡呆患者腦脊液培養(yǎng)U251細(xì)胞誘導(dǎo)隧道納米管及外泌體形成的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是以選擇性、進(jìn)行性上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害為顯著特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。額顳葉癡呆(frontotemporaldementia，F(xiàn)TD)是中老年人緩慢出現(xiàn)的以人格改變、言語障礙以及行為異常為主要臨床表現(xiàn)的一種癡呆類型。有統(tǒng)計(jì)顯示，既符合ALS又符合FTD的占10％。ALS及FTD均為以選擇性、進(jìn)行性神經(jīng)元死亡為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，

2、目前二者的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。肌萎縮側(cè)索硬化及額顳葉癡呆患者的病理學(xué)研究顯示兩者具有重疊性，即神經(jīng)系統(tǒng)殘存的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在TDP-43免疫反應(yīng)陽(yáng)性包涵體，表明兩者雖然具有不同的臨床表現(xiàn)，但可能具有相似的潛在發(fā)病機(jī)制。數(shù)年前，朊蛋白樣播散理論的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究帶來了巨大突破，異常折疊的朊蛋白可誘導(dǎo)正常的朊蛋白異常折疊聚集形成包涵體，并通過神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、擴(kuò)散至整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)的損害并出現(xiàn)相應(yīng)的

3、臨床癥狀。Tau,a-synuclein以及huntingtin陽(yáng)性包涵體已被證明可在細(xì)胞間播散，這為TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞間類似朊蛋白樣播散提供了依據(jù)。最近有研究表明從ALS及FTD患者腦組織中提取的不溶性的TDP-43蛋白可作為種子在細(xì)胞間播散。但是，目前沒有明確證據(jù)表明TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體可以在人與人之間或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間播散并導(dǎo)致疾??；此外，TDP-43免疫反應(yīng)陽(yáng)性包涵體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的播散方式仍不明

4、。隧道納米管(tunnelingnanotubes,TNTs)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞間一種新型的通訊鏈接方式，是由細(xì)胞膜及以F-actin為主的細(xì)胞骨架成分組成，一直處于形成和斷裂的持續(xù)變化狀態(tài)之中。最新的研究發(fā)現(xiàn)蛋白聚集體、病毒及朊蛋白也可通過TNTs在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)。外泌體(exosomes)——細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜性小泡，可在細(xì)胞間起到信息交流作用，參與細(xì)胞遷移、血管形成、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、組蛋白修飾等病理生理過程的信息交換及細(xì)胞間通訊。因此

5、，我們推測(cè)TNTs及exosomes可能是TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體在ALS-FTD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中播散的途徑。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立腦脊液培養(yǎng)細(xì)胞模型，研究ALS-FTD患者腦脊液誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞U251TNTs及exosome形成的機(jī)制研究,初步探討TDP-43免疫反應(yīng)陽(yáng)性包涵體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)播散的途徑。
　　方法：
　　1、本研究收集病例組肌萎縮側(cè)索硬化-額顳葉癡呆患者8例，以及正常對(duì)照組15

6、例，通過腰椎穿刺術(shù)收集腦脊液標(biāo)本。
　　2、建立腦脊液培養(yǎng)細(xì)胞模型，分別培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞U2510，1，3，5，7，10，14，18，21，28d，通過免疫熒光顯微鏡觀察TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體、TNTs、exosomes的形成,并觀察F-actin、exosomes與TDP-43是否存在亞細(xì)胞共定位,記錄表達(dá)TNTs結(jié)構(gòu)的U251細(xì)胞含量百分比。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS21.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組計(jì)

7、量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Bonferroni法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、與對(duì)照組相比，在ALS-FTD患者腦脊液（ALS-FTD-CSF）培養(yǎng)條件下，U251細(xì)胞中形成了TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體；TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體與TNTs標(biāo)記物F-actin及exosomes標(biāo)記物flotillin-1存在亞細(xì)胞共定位。
　　

8、2、與對(duì)照組相比，在ALS-FTD-CSF培養(yǎng)條件下，TNTs表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05），表達(dá)TNTs的U251細(xì)胞含量百分比在第3天開始增加(117%)，在第5天達(dá)到高峰（128%），在第10d開始逐漸下降（116%），較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、ALS-FTD患者腦脊液培養(yǎng)U251可誘導(dǎo)TDP-43免疫陽(yáng)性包涵體的形成。
　　2、ALS-FTD患者腦脊液培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)T