木犀草素、芹菜素及槲皮素對黑色素瘤自殺基因治療的增效研究.pdf

1、惡性腫瘤是21世紀以來嚴重危害人類健康的主要疾病之一，是目前導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展，基因治療對惡性腫瘤的治療有著重要作用，特別是自殺基因治療，已經(jīng)成為繼傳統(tǒng)治療手段（如手術(shù)治療、放療、化療等）后一種治療腫瘤最具希望和挑戰(zhàn)的措施。
　　目的:
　　本研究通過構(gòu)建重組慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光示蹤蛋白單純皰疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)基因載體，獲得重組活病毒并感染人黑

2、色素瘤細胞A375，在確定黃酮類中藥活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素對細胞縫隙連接功能(GJIC)的促進作用，進一步將中藥活性成分與自殺基因治療系統(tǒng)組成聯(lián)合治療方案，研究中藥活性成分聯(lián)合自殺基因治療系統(tǒng)的增效作用，通過本研究探討將自殺基因聯(lián)合中藥方藥活性成分的中西醫(yī)結(jié)合基因治療腫瘤方案的可行性。
　　方法:
　?。ㄒ唬┤撕谏亓黾毎鸄375 HSV1-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建
　　1、綠色熒光蛋白示蹤的H

3、SV1-tk/GCV系統(tǒng)重組慢病毒載體的構(gòu)建
　　設(shè)計引物，提取HEK293細胞總RNA，PCR反應(yīng)擴增tk基因后，產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。對tk基因PCR擴增產(chǎn)物及CD511B質(zhì)粒分別進行雙酶切，T4 DNA連接酶連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶消化進行鑒定及序列測定;將構(gòu)建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-tk/GFP。
　　2、人黑色素

4、瘤細胞A375 HSV1-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建
　　用該重組質(zhì)粒pLV-tk/GFP與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293T，獲得重組活病毒并感染人黑色素瘤細胞A375，用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株;使用熒光顯微鏡觀察GFP基因的表達，GCV殺傷實驗驗證tk-GFP基因的活性。將篩選獲得穩(wěn)定表達細胞命名為A375-tk/GFP。
　　（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素對人黑色素瘤細胞縫隙連接通訊功能的作用

5、r>　　1、MTT法檢測人黑色素瘤細胞A375生長曲線。
　　2、MTT法檢測0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素對A375細胞生長的影響，以確定用于研究的藥物濃度。
　　3、熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀熒光示蹤法分析縫隙連接通訊(GJIC)功能變化。用預(yù)標記雙染料傳輸流式細胞術(shù)檢測0～20μmol/L木犀草素、0～10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素對A375細胞GJIC功能的影響，并用熒光顯微鏡拍照

6、記錄實驗結(jié)果。檢測并計算單綠色熒光細胞數(shù)量與熒光雙陰性細胞數(shù)量的比值，作為評價GJIC功能的指標;比值越大表示細胞間形成GJIC功能越強。
　　4、Western Blot檢測0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素對A375細胞縫隙連接蛋白Cx43、Cx26表達的影響，對圖像進行掃描分析。
　?。ㄈ┠鞠菟?、芹菜素及槲皮素對人黑色素瘤細胞自殺基因的增效作用
　　1、MTT法檢測0、2、5μmol/L GCV對0

7、、20％、40％、60％、80％、100％ A375-tk/GFP(tk+)細胞混合A375（tk-）細胞作用72h生長的影響，以確定聯(lián)合作用GCV濃度和tk+細胞的混合比例。
　　2、MTT法檢測殺傷效應(yīng)。將tk+細胞按20％比例混合tk-細胞接種到96孔板。混合細胞分為空白組、GCV組、木犀草素組、芹菜素組、槲皮素組、木犀草素聯(lián)合GCV組、芹菜素聯(lián)合GCV組和槲皮素聯(lián)合GCV組。培養(yǎng)24h后根據(jù)分組給藥，72h后以MTT檢測各

8、組殺傷效應(yīng)。
　　3、熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀PI單染分析細胞凋亡。將tk+細胞按20％比例混合tk-細胞接種到12孔板?；旌霞毎譃榭瞻捉M、GCV組、木犀草素組、芹菜素組、槲皮素組、木犀草素聯(lián)合GCV組、芹菜素聯(lián)合GCV組和槲皮素聯(lián)合GCV組。培養(yǎng)24h后根據(jù)分組給藥，72h后以PI單染，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的情況，并用熒光顯微鏡拍照記錄實驗結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　（一）人黑色素瘤細胞A375 HSV1-tk

9、/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建
　　1、綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk/GCV系統(tǒng)重組慢病毒載體的構(gòu)建
　　重組慢病毒質(zhì)粒pLV-tk/GFP分子量約為10.0kb，經(jīng)限制性酶切鑒定和DNA序列測定分析顯示，證明目的基因tk已經(jīng)成功連接到載體正確位置，測序結(jié)果與原始載體序列比對，相應(yīng)序列100％完全一致，證明攜帶目的基因HSV1-tk的質(zhì)粒pLV-tk/GFP構(gòu)建成功。
　　2、人黑色素瘤細胞A375 HSV1-

10、tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建
　　pLV-tk/GFP感染A375細胞用0.5μg/mL嘌呤霉素維持篩選濃度2周，熒光顯微鏡觀察GFP的表達隨著時間的延長而逐漸增多、熒光增強，最終獲得重組基因整合到染色體上的穩(wěn)定表達細胞株，命名為A375-tk/GFP。
　　采用MTT法檢測GCV對A375細胞、A375-tk/GFP細胞進行殺傷試驗，GCV作用72h的細胞存活率結(jié)果顯示，GCV對A375-tk/GFP細胞有明顯的

11、殺傷作用，而對未感染重組慢病毒的對照組A375細胞無明顯細胞毒作用。
　　結(jié)果表明重組質(zhì)粒經(jīng)包裝后產(chǎn)生上清液含具有感染性的病毒顆粒，感染細胞后篩選的陽性抗性克隆細胞A375-tk/GFP能正常表達tk/GFP基因，表達產(chǎn)物具有生物活性。
　?。ǘ┠鞠菟?、芹菜素及槲皮素對人黑色素瘤細胞縫隙連接通訊功能的作用
　　1、木犀草素、芹菜素、槲皮素對A375細胞生長有較為明顯的抑制效應(yīng)，6.25～100μmol/L木犀草素、

12、芹菜素及槲皮素對A375細胞殺傷作用呈時間和劑量依賴關(guān)系;本研究主要探討木犀草素、芹菜素及槲皮素通過GJIC或細胞凋亡機制增強對A375-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)，故選用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素進行后續(xù)試驗。
　　2、流式細胞術(shù)及Western Blot檢測細胞縫隙連接功能和縫隙連接蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通過提高腫瘤細胞縫隙連接蛋白的Cx43和C

13、x26表達水平，促進縫隙連接通訊的功能從而起到與自殺基因治療系統(tǒng)的協(xié)同增效作用，旁觀者效應(yīng)也可能是通過GJIC機制發(fā)生的。
　　（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素對人黑色素瘤細胞自殺基因的增效作用
　　1、MTT法檢測2、5μmol/L GCV對20％～100％ A375-tk/GFP細胞混合比例作用72h后，對顯著的殺傷作用，為了觀察木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV治療系統(tǒng)，通過縫隙連接機制或綱胞凋亡機制增強對A375

14、-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)，故選用5μmol/L GCV和20％ A375-tk/GFP細胞混合比例進行后續(xù)實驗驗。
　　2、木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV組對腫瘤細胞的抑制率明顯比相應(yīng)濃度單藥組和單純tk/GCV組高(P＜0.05)，說明木犀草素、芹菜素及槲皮素聯(lián)合tk/GCV系統(tǒng)能顯著提高tk+和tk-混合細胞對GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素聯(lián)合tk/GCV組，5、10、20μmol/L

15、芹菜素聯(lián)合tk/GCV組，10、20μmol/L槲皮素聯(lián)合tk/GCV組，Q值均≥1.15，說明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有協(xié)同性增強tk/GCV系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用。
　　3、PI單染檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，各中藥活性成分聯(lián)合tk/GCV組的細胞凋亡率均高于單純中藥活性成分組，PI單染法檢測結(jié)果各組細胞凋亡率的趨勢與MTT結(jié)果一致，實驗證明，木犀草素、芹菜素及槲皮素

16、對A375-tk/GFP自殺基因治療系統(tǒng)具有增效作用。
　　結(jié)論:
　　上述實驗結(jié)果表明:①我們已成功構(gòu)建了綠色熒光示蹤蛋白慢病毒介導(dǎo)的HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng);②中藥活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通過提高縫隙連接蛋白的表達水平促進細胞間縫隙連接功能;③將中藥活性成分和自殺基因療法組成聯(lián)合治療方案，對人黑色素瘤自殺基因治療系統(tǒng)具有協(xié)同增效作用。
　　通過對人惡性黑色素瘤治療的實驗研究，表明自殺基因

17、療法聯(lián)合中藥方藥活性成分，能夠通過促進縫隙連接機制發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，中藥方藥活性成分能夠提高腫瘤自殺基因治療的效果。初步證明了建立自殺基因聯(lián)合中藥方藥活性成分的中西醫(yī)結(jié)合基因治療腫瘤方案具有可行性。
　　將中藥方藥活性成分與腫瘤自殺基因治療聯(lián)合，體外實驗對自殺基因治療系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的研究結(jié)果顯示，中藥方藥活性成分能協(xié)同增強腫瘤自殺基因旁殺傷效應(yīng)的效果，其可能機制與中藥方藥活性成分通過促進細胞間縫隙連接通訊功能（即縫隙連接機制）發(fā)