1,6-二磷酸果糖在游離脂肪移植中的作用及機制研究.pdf

1、近年來，自體脂肪移植術(autologous fat transplantation，AFT)被越來越多的應用于治療軟組織缺損相關疾病和美容整形手術等，逐漸受到人們的關注。然而，移植后組織成活率低、吸收率高的缺陷限制了其在臨床的廣泛應用。目前，主流觀點認為導致移植后脂肪組織吸收的原因可能與營養(yǎng)物質缺乏和氧氣供應不足有關。為了解決這一問題，臨床大夫和科研人員采取了多種方法，基本可以概括為:應用各種生長因子，應用干細胞，以及應用藥物三種策略

2、，但現(xiàn)有研究都沒有得到確切、持久、且良好的臨床效果。
　　1，6-二磷酸果糖(Fructose1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP)因對處于缺血缺氧環(huán)境中的組織器官具有良好的保護作用，而被廣泛的應用于器官移植、心肌缺血、腦組織梗死、創(chuàng)傷急救等研究及臨床實踐中。FBP能夠減少心肌或者腎臟梗死區(qū)域細胞發(fā)生凋亡壞死的數(shù)量，降低無菌性炎癥的程度，幫助其度過危險期。那么，在脂肪移植中，F(xiàn)BP是否能發(fā)揮同樣的作用，減少脂肪移植物中細胞的凋

3、亡壞死或者促進游離脂肪移植物的存活，目前還未見相關研究報道。因此，本研究，首先明確FBP在促進脂肪移植存活中的作用，隨后探討了其有效的應用時間窗等問題，并進一步從臨床角度出發(fā)，摸索其可能作用的目的細胞和具體機制。
　　目的:
　　1.明確游離脂肪移植后，移植物的動態(tài)演變過程。
　　2.明確FBP是否對游離脂肪移植物有保護作用，提高脂肪移植效果。
　　3.探討FBP發(fā)揮作用的目的細胞及具體機制。
　　方法與結

4、果:
　　1.游離脂肪移植后，移植物的動態(tài)演變過程:
　　方法:脂肪抽吸術獲得人脂肪顆粒(n=3)，注射入BALB/c裸鼠(n=3)背部皮下脊柱兩側并于術后2/8/12周取材，分別通過共聚焦顯微鏡掃描，大體觀察，體積測量，稱重，HE染色等方法，明確脂肪顆粒大小，移植物的重量、體積、及組織學變化。
　　結果:
　　①通過共聚焦顯微鏡檢測可見抽吸所得脂肪顆粒直徑在1500um-5000um區(qū)間。
　?、谥绢w粒

5、與完整組織相比，未見明顯血管結構存在，且顆粒內可見顯著的破損脂肪細胞存在。
　?、壑疽浦参镫S著時間的推移，色澤由金黃色逐漸變?yōu)榘底厣?，體積逐漸減小，重量逐漸減輕。包膜在移植后2周形成且一直持續(xù)到12周。新生的血管和幼稚脂肪細胞隨著包膜出現(xiàn)，并伴隨纖維間隔的長入。位于移植物外圍區(qū)域的脂肪細胞始終保持較好的形態(tài)和完整性，而位于移植物中心區(qū)域的大部分脂肪細胞在術后第2周就已經(jīng)壞死，形成多個空腔。
　　2.FBP在游離脂肪移植中的

6、作用:
　　方法:脂肪移植術前2小時內注射不同濃度的FBP進行預處理，術后連續(xù)六天腹腔注射給藥。實驗分為4mg/g（每單位小鼠體重所用藥物質量）、2.5mg/g、1mg/g、0.5mg/g FBP應用組和對照組（每組裸鼠為8-12只）。術后2/8/12周分別對移植物稱重，測量長寬高，利用組織學、酶活性檢測、以及Real-Time PCR等方法對移植物的重量、體積、完整細胞保有情況、存活細胞活性、以及脂肪細胞和血管新生情況進行評估。

7、
　　結果:
　?、俑鹘M脂肪移植物均隨時間延長，呈現(xiàn)體積減小、重量減輕的趨勢;在第12周，4mg/g用藥組的移植物體積和重量保留均優(yōu)于對照組。
　　②細胞計數(shù)結果顯示移植物邊緣區(qū)域的完整細胞數(shù)量在術后第2周及第12周高濃度用藥組多于對照組，中心區(qū)域兩者之間的區(qū)別則呈現(xiàn)出一個從有到無的變化。移植后第2周和第12周，4mg/g組的存活脂肪細胞數(shù)量均多余對照組，且2周時4mg/g用藥組組織水平PPARr表達量更高。酶活性檢測

8、顯示高濃度給藥組存活的脂肪細胞活性在第2周時明顯優(yōu)于對照組，且一直持續(xù)到第12周。術后5天實驗組存活脂肪細胞數(shù)量顯著多于對照組。
　?、坌律軘?shù)量在第2周時4mg/g與2.5mg/g用藥組與對照組有顯著性差異，同時，血管形成相關基因VEGF的表達在實驗組明顯高于對照組，但到第12周時兩者之間新生血管數(shù)量沒有顯著差異。
　　3.FBP在游離脂肪移植中的作用機制探索:
　　方法:我們從缺氧、營養(yǎng)物質缺乏、和炎癥三個方面，

9、探討FBP改善游離脂肪移植效果的可能機制。通過Real-time PCR和免疫熒光檢測，明確移植物炎癥狀態(tài)。通過控制氧氣張力和營養(yǎng)成分明確氧氣剝奪或者營養(yǎng)剝奪兩種因素對脂肪間充質干細胞(n=3)和成熟脂肪細胞(n=3)的影響，并通過添加FBP后的改善情況，明確FBP在改善缺氧和營養(yǎng)物質缺乏中的作用。進而，通過飽和脂肪酸刺激實驗檢測FBP是否能夠降低成熟脂肪細胞的炎癥因子及炎癥受體的表達水平，明確其在改善炎癥方面的作用。具體FBP應用分組

10、情況為:2mmol/L、1mmol/L、0.5mol/L FBP應用組和對照組。
　　結果:
　?、僦疽浦残g后5天，4mg/g用藥組的炎癥因子TNFa的表達水平與對照組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，且組織內巨噬細胞侵蝕情況較輕;其他炎癥相關指標也表現(xiàn)出相同的趨勢;術后2周差異消失。
　　②1mmol/L FBP存在時，hASCs在氧氣張力正常和無血清培養(yǎng)條件下增殖能力與對照組相比出現(xiàn)了顯著區(qū)別，實驗組活細胞數(shù)目明顯多于無血清且無藥

11、物組;氧氣張力正常而有血清存在時則無此現(xiàn)象;0.5mmol/L FBP存在且培養(yǎng)環(huán)境中氧氣和血清缺乏時，hASCs的增殖能力也表現(xiàn)一定的優(yōu)勢;0.5mmol/L FBP存在且缺乏氧氣而有血清時，hASCs的增殖能力有明顯優(yōu)勢;低氧張力且無血清處理12小時，三組細胞之間也顯示出了類似的趨勢;對NF-kB和Caspase8檢測發(fā)現(xiàn)無論處理12或24小時，組與組之間并沒有表現(xiàn)出顯著差異;對TLR4與IL-1B進行檢測后發(fā)現(xiàn)氧分壓正常且無血清時

12、，加入0.5mmol/L和1mmol/L的FBP均能在一定程度上放緩兩者的上升趨勢。
　?、塾靡陨戏椒ㄌ幚沓墒熘炯毎毎蛲鏊讲]有表現(xiàn)出顯著區(qū)別;活/死細胞數(shù)量呈現(xiàn)出與脂肪間充質干細胞類似的趨勢;低氧張力且有血清時，1mmol/L的FBP能夠增加脂肪細胞PPARr的表達水平。在常氧張力且無血清時，1mmol/L的FBP能夠增加脂肪細胞對葡萄糖的利用。培養(yǎng)幾種加入FBP時用500umol/L的棕櫚酸鈉刺激脂肪細胞后，IL-1

13、β的表達水平較低。
　　結論:
　　1.臨床吸取的游離脂肪標本呈不規(guī)則的顆粒狀，直徑介于1500um-5000um之間;移植后，脂肪組織內的細胞由2周的凋亡壞死，發(fā)展至8周時部分再生重建，直到第12周移植組織基本穩(wěn)定，呈現(xiàn)出一個動態(tài)變化的過程。
　　2.應用4mg/g FBP能夠較好的保留脂肪組織的體積、重量，同時促進移植物內保留更多完整的脂肪細胞，并且促進血管的生成;應用4mg/g FBP還能夠保護移植物內脂肪細胞糖

14、脂代謝的關鍵酶類免受缺血缺氧的影響;FBP呈現(xiàn)出一個對脂肪移植物多方位和動態(tài)的保護過程。
　　3.FBP能夠降低移植組織的TNFa以及IL-1β等炎癥因子的水平，同時下調炎癥通路中重要受體Toll-like receptor4的表達水平;特定濃度的FBP能夠在細胞增殖、細胞凋亡壞死、細胞炎癥因子和炎癥受體表達水平、以及細胞葡萄糖利用能力等方面產生廣泛影響，最終作用是使處于不良環(huán)境中的脂肪間充質干細胞保持良好的增殖能力，減少脂肪間充