50Hz電磁場(chǎng)暴露對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、50 Hz電磁場(chǎng)(50 Hz-EMF)是目前環(huán)境中普遍存在的一類極低頻電磁場(chǎng)，其對(duì)人類健康的影響一直備受公眾關(guān)注且飽受爭(zhēng)議。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電磁輻射最敏感的靶器官（系統(tǒng)）之一。胚胎期腦發(fā)育是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的關(guān)鍵階段，對(duì)電磁輻射暴露更為敏感。胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新、定向分化、遷移等過程直接影響到胚胎期腦的正常發(fā)育。既往研究發(fā)現(xiàn)，50 Hz-EMF暴露通過促進(jìn)NSCs的增殖和分化來引起成年小鼠神經(jīng)發(fā)生甚至增強(qiáng)了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。然而

2、，50 Hz-EMF暴露對(duì)胚胎期腦發(fā)育的影響仍存在爭(zhēng)議且相關(guān)機(jī)制不清。因此，本實(shí)驗(yàn)研究通過分離培養(yǎng)eNSCs，建立體外細(xì)胞模型，觀察50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs增殖和分化的影響，從TRPCs鈣通道及其直接調(diào)控eNSCs增殖和分化的bHLH相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子入手，探討相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法:①取胚胎期約13.5天(E13.5)的胎鼠端腦組織體外培養(yǎng)得到eNSCs。采用目前研究中兩種常見的暴露模式進(jìn)行50 Hz-EMF暴露。具體的

3、暴露條件如下:模式1∶0.5、1、2mT;5分鐘開/10分鐘關(guān)(5 min on/10 min off);1、2、3 d;模式2∶1 mT;4小時(shí)/天(4 h/d);1、2、3d。
　?、诓捎肅CK-8、EdU、神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期流式分析、real time PCR、TUNEL和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs增殖、維持、分化、凋亡以及分化神經(jīng)元突出生長(zhǎng)的影響。
　?、鄄捎胷eal time

4、 PCR、Westem blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)50 Hz-EMF暴露對(duì)調(diào)控eNSCs增殖和分化的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的影響，進(jìn)一步在分子水平上驗(yàn)證50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs細(xì)胞行為的影響。
　?、懿捎胷eal time PCR、Western blot檢測(cè)50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs分化過程中TRPCs通道的影響;采用鈣熒光探針Fura2-AM檢測(cè)50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs中鈣離子濃度的影響;
　

5、?、莶捎肨RPC1-siRNA干擾下調(diào)TRPC1的表達(dá)后，觀察50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs分化過程中相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化以及神經(jīng)元的定向分化和分化神經(jīng)元突出生長(zhǎng)情況，探討TRPC1在50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs分化的分子機(jī)制。
　?、薏捎肧PSS20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:①暴露模式1的(0.5-2 mT,5 min on/10 min off)條件下，e

6、NSCs的細(xì)胞活力、EdU陽性細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞周期相關(guān)基因（P53、P21和GADD45）、神經(jīng)球直徑無明顯變化;分化的神經(jīng)元（Tuj1陽性細(xì)胞）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性細(xì)胞）的數(shù)目也未受顯著影響;而分化過程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變（Sox2 mRNA降低;Math1、Math3、Ngn1和Tuj1的mRNA升高）。
　　②暴露模式2(1 mT,4 h/d)條件下，50 Hz-EMF暴露3d后，eNSC的細(xì)胞活力、E

7、dU陽性數(shù)目、初級(jí)和次級(jí)神經(jīng)球數(shù)目顯著增加，并且調(diào)控細(xì)胞增殖的基因(Sox2、Hes1和Hes5)mRNA表達(dá)水平在暴露1d和3d時(shí)均明顯升高;50 Hz-EMF暴露3d后，由eNSC分化來的神經(jīng)元（Tuj1陽性細(xì)胞）數(shù)目、Tuj1 mRNA表達(dá)以及分化神經(jīng)元的突出總長(zhǎng)度和分支數(shù)目顯著增加，而星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性細(xì)胞）數(shù)目和GFAPmRNA以及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯改變;50 Hz-EMF暴露3d引起分化eNSC中原神經(jīng)基因

8、NeuroD和Ngn1 mRNA和蛋白表達(dá)升高;50 Hz-EMF暴露2d和3d時(shí)，分化eNSC中TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，并且細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加;采用TRPC1-siRNA下調(diào)TRPC1表達(dá)后，再進(jìn)行50 Hz-EMF暴露3d，發(fā)現(xiàn)50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSCs向神經(jīng)元分化、分化神經(jīng)元的突出生長(zhǎng)、NeuroD和Ngn1 mRNA表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響得以阻止。
　　結(jié)論:①50 Hz-EMF暴露對(duì)eNSC

9、s的影響依賴于具體的暴露模式。間斷暴露(0.5-2 mT,5min on/10 min off)未改變細(xì)胞的增殖和定向分化;相對(duì)連續(xù)的暴露(1 mT,4h/d)促進(jìn)eNSCs的增殖和向神經(jīng)元的分化及其突出生長(zhǎng)。
　?、?0 Hz-EMF暴露(1 mT,4h/d)引起直接調(diào)控eNSCs增殖和定向分化的bHLH相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
　?、?0 Hz-EMF暴露(1 mT,4h/d)引起分化eNSCs中TRPC1鈣通道表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)