復方“前愈”治療慢性非細菌性前列腺炎藥效物質基礎研究.pdf

1、目的：
　　中藥復方以中醫(yī)理論為基礎，運用“君臣佐使”原則多味藥物以合適劑量配伍而成，發(fā)揮藥效的物質基礎復雜多樣，嚴重阻礙了中藥現(xiàn)代化進程。復方“前愈”是武漢市第三醫(yī)院治療慢性非細菌性前列腺炎（chronic non-bacterial prostatitis，CNP）的經(jīng)驗方，前期藥效學研究、拆方實驗及長期臨床觀察等從不同角度證實其可發(fā)揮顯著治療效果，本研究結合前期實驗，查閱方中各藥材功能主治，化學成分，動物模型制備及藥理活性研

2、究等相關文獻資料后，以臨床患者服用的傳統(tǒng)劑型為基礎，從復方“前愈”水煎液中純化總黃酮、總多糖、總皂苷等化學部位，進而通過慢性非細菌性前列腺炎藥理模型，篩選出活性成分，以期闡明“前愈”治療慢性非細菌性前列腺炎的藥效物質基礎，為后期開發(fā)有效部位新藥及新劑型提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　本文沿用中藥湯劑傳統(tǒng)臨床給藥形式，對復方“前愈”方進行提取，選取總多糖、總黃酮及總皂苷三個化學部位，運用現(xiàn)代色譜理論，化學分析，儀器分

3、析方法進行純化及含量測定，使其達到新藥申報中中藥有效部位可測量物質含量占總提取出物質50％的要求，結合藥理學研究模式，制備慢性非細菌性前列腺炎大鼠動物模型，通過測定前列腺指數(shù)，HE染色觀察病理組織改變，同時檢測大鼠慢性非細菌性前列腺炎相關細胞因子，考察不同化學部位及其組合對于治療慢性非細菌性前列腺炎的藥效活性，從中篩選有效化學部位及其組合，闡明藥效物質基礎。
　　純化總多糖和總皂苷工藝流程中，對復方“前愈”方兩次煎煮合并藥液，用無

4、水乙醇醇沉粗多糖，濾液備用，將粗多糖復溶，除蛋白，透析得純化多糖；濾液旋轉蒸干，復溶，氯仿萃取，水層調(diào)PH值，通過聚酰胺樹脂柱，乙醇洗脫得純化總黃酮；在總皂苷純化中，選取復方“前愈”水煎液，石油醚萃取，水層用水飽和的正丁醇溶液進行萃取，合并正丁醇旋干，采用濕法裝柱干法上樣的方法通過大孔樹脂柱得純化總皂苷。
　　總多糖部位的純化工藝研究及含量測定，以無水葡萄糖為對照品采用苯酚-硫酸分光光度法測定多糖純度，在復溶固液比、除蛋白次數(shù)、透

5、析時間三個單因素的試驗基礎上，通過正交試驗優(yōu)選“前愈”多糖最佳純化工藝條件。取6劑前愈處方量(處方組成：生黃芪、淫羊藿、益母草、川黃柏、懷牛膝，共100g)藥材共600g，去離子水浸泡12h，煎煮二次，合并濾液濃縮得“前愈”水煎液，加無水乙醇醇沉過夜，過濾，干燥得粗多糖，加水，臵磁力攪拌器加熱復溶，離心取上清夜，加入相當于1/4體積的Sevag試劑充分攪拌，離心，上清液透析過夜，取出，冷凍干燥，即得純化總多糖。
　　總黃酮部位的純

6、化工藝研究及含量測定，以總黃酮含量為指標，采用分光光度法，利用靜態(tài)和動態(tài)相結合方法，考察純化過程中上樣液質量濃度、pH、樹脂藥材比、洗脫溶劑選擇及用量等工藝參數(shù)，對聚酰胺樹脂純化總黃酮部位的行為進行評價。將“前愈”水煎液加無水乙醇醇沉，濾過，濾液臵旋轉蒸發(fā)儀中旋干，加去離子水溶解得生藥質量濃度1g·ml-1溶液，氯仿萃取，收集水層，調(diào)pH，通過處理好的聚酰胺樹脂，依次用去離子水、乙醇進行洗脫，收集洗脫液，干燥，得純化總黃酮。
　　

7、皂苷部位的純化工藝及含量測定，選用D101大孔樹脂進行富集，含量測定采用香草醛-硫酸反應。取“前愈”水煎液，石油醚萃取，收集水層，水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇臵旋轉蒸發(fā)儀中，加入適量處理后的D101大孔樹脂，震搖使藥材完全吸附在樹脂上，旋干，裝柱，然后用去離子水、10%乙醇洗脫除雜，50%乙醇富集總皂苷部位，減壓干燥，得純化總皂苷。
　　慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的制備，SPF級八周齡雄性 SD大鼠，飼養(yǎng)一周適應環(huán)境，采用完全隨

8、機法分組：空白組、模型組、陰性組和給藥組（陽性藥組、水煎液組、總多糖組、總黃酮組、總皂苷組、總多糖+總黃酮組、總多糖+總皂苷組、總黃酮+總皂苷組、總多糖+總黃酮+總皂苷組）。烏拉坦進行麻醉，固定，手術部位消毒，腹腔右下部位切口，暴露前列腺組織，兩側前列腺分別注射1%角叉菜膠生理鹽水，縫合切口，陰性組注射同等劑量的生理鹽水，空白組不做任何處理，造模后1周，給藥劑量按原水煎液成人服用量、純化前后各化學部位質量及純度進行換算，空白組和陰性組給

9、以同等劑量的生理鹽水三周，最后一次給藥后，饑餓，稱大鼠體重、處死，取前列腺組織，稱取濕重，分別做 ELISA分析和組織病理切片，觀察各組大鼠前列腺組織的病理變化和相關指標的改變，評價和篩選“前愈”中總多糖、總黃酮、總皂苷對于治療慢性非細菌性前列腺炎的有效部位及其組合，探討其發(fā)揮藥效的物質基礎。
　　結果：
　　為明確復方“前愈”有效部位和發(fā)揮藥效的物質基礎，采用色譜學等技術，分離其中總多糖、總黃酮及總皂苷三個化學部位，在動物

10、模型基礎上考察藥效活性。
　　在總多糖純化工藝及含量測定中，考察純化過程中復溶固液比、除蛋白次數(shù)、透析時間關鍵技術對總多糖純度的影響，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)選“前愈”多糖最佳純化工藝條件，即固液比為1:40（g/ml，w/v）、脫蛋白10次、透析18h，此條件下純化多糖純度可達69.04%，轉移率51.84%，工藝流程簡便可行，重復性好，可以用于復方“前愈”中多糖部位的純化工藝。
　　在總黃酮部位純化工藝研究及含量測定中

11、，以總黃酮含量為指標，采用聚酰胺樹脂考察上樣液質量濃度、pH、樹脂藥材比、洗脫溶劑選擇及用量等工藝參數(shù)，確定上樣液質量濃度1.0 g·ml-1，pH3.0，5BV水洗脫除雜，4BV50%乙醇洗脫為最佳純化工藝，此工藝條件下，總黃酮純度由8.89%提高到63.67%，純化效果較好，可顯著提高總黃酮純度，工藝條件穩(wěn)定可行。
　　總皂苷部位的純化及含量測定，采用大孔樹脂填充柱，濕法裝柱干法上樣，用去離子水、10%、30%、50%、70%

12、、90%不同濃度的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，測定其中總皂苷含量，優(yōu)選去離子水及30%乙醇洗脫除雜，70%乙醇洗脫為最佳工藝，即得純度較高“前愈”總皂苷，純度56.93%。
　　采用角叉菜膠化學刺激法制備慢性非細菌性前列腺模型，模型組前列腺指數(shù)明顯升高，且肉眼觀察組織紅腫和周圍組織出現(xiàn)黏連，在病理組織切片中，模型組大鼠前列腺組織出現(xiàn)嚴重的彌散性慢性炎癥特征，如前列腺上皮高度增加，葉狀乳頭深入腺腔、前列腺側葉腺腔直徑變小，淋巴細胞等炎

13、癥細胞浸潤，表明試驗中大鼠CNP動物模型制備成功，且排除生理鹽水對其炎癥的影響。給藥后，與模型組相比，陽性藥組、“前愈”水煎液、化學部位及各組合組前列腺組織的炎癥狀況都有所改善，其中，陽性藥組、“前愈”水煎液組及總多糖+總黃酮+總皂苷組改善顯著，腺上皮細胞排列整齊，間質炎癥細胞浸潤較少。各項指標檢測結果顯示，總多糖、總黃酮、總皂苷三種化學成分對模型組中異常升高的各項細胞因子具有不同程度的抑制作用，在單個化學成分給藥時，盡管對于一些細胞因

14、子有降低作用，但是效果不顯著，如：總多糖可以降低 COX-2、總皂苷可以一定程度上降低iNOS活力和NO含量，總黃酮可以降低PGE2高表達。在各種化學成分兩兩配伍給藥中對 TGF-β1、TNF-α、IL-1β、NO含量的影響主要來總黃酮和總皂苷成分，對PGE2、iNOS抑制作用主要來自總多糖和總皂苷成分，對COX-2含量的影響主要來自總多糖和總黃酮成分，三化學成分配伍使用對 TNF-α、PGE2、IL-1β、TGF-β1、COX-2、i

15、NOS及NO異常升高具有抑制作用。
　　結論：
　　本實驗通過研究各化學部位的純化工藝，總多糖純化工藝中，采用水提醇沉，除蛋白、透析法等得純度較高的總多糖，通過聚酰胺樹脂純化總黃酮，采用大孔樹脂濕法裝柱干法上樣，純化得純度較高“前愈”總皂苷化學部位，然后采用化學刺激法制備大鼠慢性非細菌性前列腺炎模型，利用大鼠疾病模型，篩選復方“前愈”對于治療慢性非細菌性前列腺炎的藥效物質基礎，三個化學部位對大鼠疾病狀態(tài)均有不同程度治療作用，