皮膚損傷的細(xì)胞代謝特征譜研究.pdf

1、燒燙傷是全球重要的公共健康問(wèn)題，皮膚由于液體燙傷，接觸性燙傷，火焰，紫外/紅外照射，輻射，電化學(xué)等因素引起多層或全部皮膚細(xì)胞的破壞而造成燒燙傷。燒傷和直接創(chuàng)傷將誘使系統(tǒng)免疫反應(yīng)綜合癥，在嚴(yán)重?zé)齻颊咧校獫{外滲進(jìn)入組織引起全身性炎癥反應(yīng)和血管通透性增加造成組織水腫。燒燙傷發(fā)生過(guò)程中修飾機(jī)體代謝主要表現(xiàn)為能量消耗增加，分解代謝增強(qiáng)，特征標(biāo)記蛋白丟失，肌肉蛋白質(zhì)重新分配，導(dǎo)致機(jī)體組織的重組和重構(gòu)。重度燒傷創(chuàng)面愈合后往往會(huì)導(dǎo)致疤痕組織形成和攣

2、縮橫跨關(guān)節(jié)，限制運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量?？紤]皮膚燒燙傷的分子機(jī)理尚不完全明晰，因此建立皮膚細(xì)胞損傷的代謝特征譜將有助于理解皮膚損傷的分子特征，鑒定新的靶點(diǎn)和靶點(diǎn)群，用于防治燒燙傷藥物功能組分的發(fā)現(xiàn)與表征，以及組織修復(fù)與再生方法的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，更好治療燒燙傷，提高患者的生存質(zhì)量。基于此，本研究基于人永生化角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT)，利用三種典型的化學(xué)試劑(雙氧水－H2O2,苯酚－PH，脂多糖－LPS),實(shí)驗(yàn)?zāi)M誘導(dǎo)皮膚損傷的病理學(xué)過(guò)程，整合

3、應(yīng)用NMR和GC/MS的代謝組學(xué)分析方法表征皮膚損傷的細(xì)胞代謝特征譜，從系統(tǒng)代謝角度表征不同化學(xué)因素誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞損傷的代謝特征譜，結(jié)合掃描電鏡可視化表征，確定最適皮膚損傷細(xì)胞模型，用于皮膚損傷代謝機(jī)理研究和確有療效中藥功能組分的快速篩選和功能研究，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與鑒定皮膚損傷發(fā)生發(fā)展的特征型代謝標(biāo)記物，以動(dòng)態(tài)監(jiān)控臨床燒燙傷治療過(guò)程和治療效果評(píng)估。
　　首先，本研究基于多尺度濃度優(yōu)化建立基于H2O2, PH和LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，優(yōu)化

4、細(xì)胞代謝物的提取、富集、衍生化和氘代試劑的濃度，并對(duì)分析儀器表征參數(shù)進(jìn)行全局優(yōu)化，建立一套普適于細(xì)胞代謝組研究的基于NMR和GC/MS的代謝組分析方法。整合生物數(shù)據(jù)分析軟件與在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，對(duì)獲得的高通量代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，鑒定皮膚損傷發(fā)生過(guò)程中對(duì)區(qū)組有顯著貢獻(xiàn)作用的特征差異性代謝物。并對(duì)鑒定出的代謝物進(jìn)行代謝通路歸屬構(gòu)建，基于代謝通路生物功能的修飾變化理解皮膚損傷發(fā)生過(guò)程中的分子特征和機(jī)理。
　　其次，本研究利用所優(yōu)

5、化建立的細(xì)胞代謝組學(xué)分析方法，建立與表征上述三種化學(xué)因素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的代謝特征譜。通過(guò)多種模式識(shí)別方法整合應(yīng)用于獲得的代謝特征譜原始數(shù)據(jù)分析，本研究從不同因素誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的提取物中共發(fā)現(xiàn)和鑒定27個(gè)與皮膚損傷顯著關(guān)聯(lián)的特征差異性代謝產(chǎn)物。這些代謝物主要包括氨基酸：丙氨酸，天冬酰胺，精氨酸，谷氨酰胺，纈氨酸，組氨酸，脯氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，鳥(niǎo)氨酸，天冬氨酸和谷氨酸；與能量循環(huán)相關(guān)的蘋(píng)果酸，檸檬酸，葡萄糖，阿洛糖，丙酮酸，

6、甘油，硬脂酸，脂類(lèi)，乳酸，呋喃糖；以及其它：肌酸，膽堿，腺苷，肌酸酐，谷胱甘肽。其中NMR細(xì)胞代謝特征譜分析發(fā)現(xiàn)與鑒定的特征差異代謝物包括組氨酸，脯氨酸，乳酸，谷胱甘肽，賴(lài)氨酸，鳥(niǎo)氨酸，天冬酰胺，肌酸，檸檬酸，脂類(lèi)，天冬氨酸，丙氨酸，膽堿，蘋(píng)果酸，精氨酸，天冬酰胺，腺苷，纈氨酸和谷氨酰胺代謝物?；贕C/MS的細(xì)胞代謝特征譜分析發(fā)現(xiàn)和鑒定的主要是天冬氨酸，甘油，亮氨酸，乳酸，谷氨酸，阿洛糖，果糖，賴(lài)氨酸，葡萄糖，絲氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺

7、，丙氨酸，麥芽糖，正亮氨酸，丙酮酸，硬脂酸，甘油，異亮氨酸，纈氨酸代謝物。其中脯氨酸，乳酸，谷氨酰胺，纈氨酸，丙氨酸，天冬氨酸和賴(lài)氨酸是兩個(gè)代謝組分析方法重疊發(fā)現(xiàn)與表征的代謝產(chǎn)物。進(jìn)一步對(duì)這些顯著性差異性的代謝物進(jìn)行分類(lèi)，富集和代謝通路歸屬分析，結(jié)果顯示這些特征差異代謝物主要?dú)w屬于糖酵解、脂代謝、磷酸戊糖途徑，三羧酸循環(huán)，和尿素循環(huán)。生物功能關(guān)聯(lián)分析結(jié)果證實(shí)這些修飾代謝產(chǎn)物功能的改變，以及代謝通路表達(dá)活性的變化有效詮釋了皮膚損傷發(fā)生的分

8、子特征和代謝機(jī)理，其與臨床燒燙傷的病理過(guò)程呈現(xiàn)高度一致性。
　　綜上所述，本研究成功建立基于NMR和GC/MS的全局性細(xì)胞代謝組分析方法，有效應(yīng)用于皮膚損傷的細(xì)胞代謝特征譜研究，從系統(tǒng)代謝角度認(rèn)識(shí)不同化學(xué)因素誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞損傷的生物化學(xué)變化過(guò)程，進(jìn)而從實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒嵌燃由罾斫馄つw損傷的代謝特征和機(jī)理。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與鑒定皮膚損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的特征性代謝標(biāo)記物，以監(jiān)控?zé)隣C傷的臨床治療過(guò)程和治療效果評(píng)估。并且從特征性代謝產(chǎn)物及其代謝通路的調(diào)控與