誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞腦移植后的區(qū)域特異性存活和分化及其誘發(fā)的局部免疫排斥反應(yīng).pdf

1、目的：誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞( induced neural stem cells，iNSCs)可通過(guò)在成體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入特定外源因子而獲得，其在顱內(nèi)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。有研究證實(shí)，iNSCs能夠在體外條件下分化為成熟神經(jīng)元等細(xì)胞，本文旨在探討iNSCs在成體腦內(nèi)不同區(qū)域的存活、遷移和分化等潛能，并對(duì)其顱內(nèi)移植是否誘發(fā)局部免疫排斥反應(yīng)做初步研究。
　　方法：無(wú)血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)iNSCs，體外觀察細(xì)胞增殖

2、狀況，并進(jìn)行巢蛋白（Nestin）熒光鑒定實(shí)驗(yàn)；制備iNSCs細(xì)胞懸液；36只成年健康C57雄性小鼠按移植時(shí)間、移植腦區(qū)不同隨機(jī)分組，每組4只，具體如下：2周移植組（海馬區(qū)、皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)、皮層感覺(jué)區(qū)、紋狀體區(qū)），6周移植組（海馬區(qū)、皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)、皮層感覺(jué)區(qū)、紋狀體區(qū)和空白對(duì)照組）；依照分組，借助鼠腦立體定位儀，將iNSCs細(xì)胞懸液通過(guò)微量進(jìn)樣器移植到C57小鼠相應(yīng)腦區(qū)；小鼠存活一定時(shí)間后，經(jīng)灌注固定取材腦組織，移植位點(diǎn)連續(xù)切片；熒光顯微鏡下

3、借綠色熒光標(biāo)記蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）觀察各腦區(qū)iNSCs存活及遷移狀況；借助細(xì)胞特異性抗體Nestin、Tuj1、MAP2、GFAP等對(duì)移植位點(diǎn)腦組織切片進(jìn)行免疫熒光鑒定，探究移植iNSCs分化狀況；借助免疫細(xì)胞特異抗體CD8、CD3、CD45等探究移植位點(diǎn)局部免疫淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　結(jié)果：iNSCs體外傳代培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定地克隆增殖，傳代細(xì)胞熒光鑒定呈Nestin陽(yáng)性；兩時(shí)間節(jié)點(diǎn)

4、，不同腦區(qū)均發(fā)現(xiàn)有移植iNSCs的存活，且2周時(shí)比較不同腦區(qū)iNSCs存活百分比發(fā)現(xiàn)存在顯著差異（P<0.05），紋狀體區(qū)、海馬區(qū)細(xì)胞存活比例相對(duì)較高；移植6周與2周對(duì)比，發(fā)現(xiàn)iNSCs可向周?chē)X實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移,且遷移呈現(xiàn)一定區(qū)域特異性，GFP陽(yáng)性細(xì)胞可沿顆粒下層形成明顯遷移條帶；iNSCs移植2周和6周組，各腦區(qū)存活細(xì)胞經(jīng)熒光鑒定均顯示Tuj1陰性；6周組部分存活細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性，計(jì)算不同腦區(qū)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞比率，結(jié)果顯示存在差

5、異（P<0.05）,海馬區(qū)較高;6周組，紋狀體和腦皮層區(qū)的存活細(xì)胞，部分可呈GFAP陽(yáng)性，海馬區(qū)臨近側(cè)腦室區(qū)域，有細(xì)胞可呈MAP2陽(yáng)性；6周時(shí)，各腦區(qū)移植位點(diǎn)存活細(xì)胞周?chē)l(fā)現(xiàn)有CD8陽(yáng)性、CD3陽(yáng)性、CD45陽(yáng)性免疫淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以海馬區(qū)為例，移植組與對(duì)照組相比，免疫細(xì)胞數(shù)目存在顯著差異（P<0.05）.
　　結(jié)論:iNSCs體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定地克隆增殖，并保持其神經(jīng)干細(xì)胞特質(zhì)；iNSCs能夠存活并逐步整合于局部腦組織，但其