脂筏標志蛋白Flotillin-1在小細胞肺癌組織中的表達及其功能研究.pdf

1、目的：研究脂筏標志蛋白 Flotilin-1在小細胞肺癌病人肺癌組織中的表達情況以及對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討Flotilin-1抑制小細胞肺癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的可能機制。
　　方法：
　　1、應用全細胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（SELEX）的篩選方法，篩選出多條能特異性識別小細胞肺癌細胞系的核酸適配體C1、C3、C7、C12。
　　2、體外合成生物素標記的序列C1、C3、C7、C12

2、作為誘餌，釣取與之結合的蛋白。采用質(zhì)譜鑒定所結合的蛋白，根據(jù)質(zhì)譜分析得分情況挑選了脂筏標志蛋白FLOT1做后續(xù)研究。
　　3、應用核酸Pull-down驗證FLOT1與C12是否特異性結合。
　　4、應用免疫組化檢測FLOT1在肺部疾病組織芯片的表達情況。
　　5、應用免疫組化檢測FLOT1在小細胞肺癌組織中的表達情況。
　　6、應用免疫熒光檢測FLOT1在小細胞肺癌細胞中的定位。
　　7、應用 RTCA

3、MP實時細胞功能分析儀、Transwell遷移和 Matrigel侵襲實驗檢測敲低FLOT1對肺癌細胞增殖活性、遷移能力和侵襲能力的影響。
　　8、建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系shNC,shFLOT1-1,shFLOT1-2，應用western-blot實驗驗證細胞敲降效率。
　　9、應用流式細胞術（ Flow Cytometry, FCM）檢測敲低 FLOT1后NCIH446 cells細胞周期的改變。
　　10、Western

4、blot實驗檢測敲低FLOT1后cyclinD1的表達情況。
　　11、對 FLOT1進行敲降后，經(jīng)不同濃度順鉑誘導 shNC, shFLOT1-1, shFLOT1-2三組小細胞肺癌細胞，檢測三組細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2， Caspase3，PAKT，PARP的表達情況。
　　12、應用流式細胞術檢測經(jīng)順鉑誘導后三組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的細胞凋亡情況。
　　13、行裸鼠皮下成瘤及裸鼠尾靜脈注射實驗,檢測shNC， shFL

5、OT1-1兩組裸鼠小細胞肺癌轉(zhuǎn)移情況。
　　14、用表達譜芯片尋找 shNC和 shFLOT1-1兩組細胞中表達差異的mRNA。
　　15、在兩組細胞中應用 Real-timePCR對表達譜芯片結果挑選出的CDC42、SOX11、CXCR2、Twist2的表達進行驗證。
　　16、應用Western blot檢測TGF-β，H-Ras在shNC、shFLOT1-1和shFLOT1-2三組細胞中的表達情況。
　　結

6、果：
　　1、質(zhì)譜分析結果顯示脂筏蛋白FLOT1能夠與C12結合。
　　2、核酸pulldown結果顯示FLOT1與C12特異性結合。
　　3、組織芯片免疫組化結果顯示FLOT1在大部分肺部疾病中表達上調(diào)，在健康人肺組織中不表達或低表達。
　　4、小細胞肺癌病人免疫組化顯示 FLOT1在癌組織中表達上調(diào)，在正常組織中不表達或低表達。
　　5、免疫熒光結果顯示 FLOT1大部分定位于細胞膜上，僅少量在細胞漿中

7、表達。
　　6、RTCA MP實時細胞功能分析結果顯示，敲降FLOT1后小細胞肺癌細胞NCIH446和NCIH1688增殖活性明顯降低(P<0.05)。
　　7、Transwell遷移結果顯示，敲降FLOT1后，小細胞肺癌細胞NCIH446和NCIH1688細胞遷移能力降低（P<0.05）。Matrigel侵襲實驗結果顯示，敲降FLOT1-1后，小細胞肺癌細胞NCIH446和NCIH1688細胞侵襲能力減弱（P<0.05）。

8、
　　8、流式細胞術檢測結果顯示敲低 FLOT1后，小細胞肺癌細胞系NCIH446細胞周期阻滯在G0/G1期（P<0.05）。
　　9、Western blot實驗顯示，敲低FLOT1后,小細胞肺癌細胞NCIH446中cyclinD1的表達降低。
　　10、Western blot實驗顯示，敲低FLOT1后，小細胞肺癌細胞NCIH446在經(jīng)順鉑處理后Bcl-2，PAKT的表達量增加，且Caspase3和PARP剪切比例

9、增加。
　　11、流式細胞術檢測結果顯示，經(jīng)順鉑誘導后敲低FLOT1的NCIH446的細胞凋亡率明顯增加（P<0.05）。
　　12、裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示，敲降FLOT1-1組皮下腫瘤重量降低（P<0.05)。
　　13、裸鼠尾靜脈注射實驗結果顯示：sh-NC組裸鼠肺部發(fā)現(xiàn)了大量癌細胞轉(zhuǎn)移,shFLOT1-1和sh FLOT1-2組肺部未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)少量癌細胞轉(zhuǎn)移灶。
　　14、Real-time PCR結果顯

10、示敲低FLOT1后，CDC42、SOX11、Twist2相對表達水平下調(diào)。
　　15、Western blot結果顯示TGF-β，H-Ras在shFLOT1-1、shFLOT1-2兩組細胞中的表達相對于在shNC組表達水平下調(diào)。
　　結論：
　　脂筏蛋白FLOT1在小細胞肺癌組織中表達上調(diào),抑制FLOT1的表達能抑制小細胞肺癌細胞增殖活性及克隆形成能力，且能夠抑制小細胞肺癌細胞的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移能力，還可促進小細胞肺癌細