大承氣湯及大黃素對(duì)大鼠腦出血的治療作用及對(duì)Nrf2-Src-MAPKs通路的影響.pdf

1、背景：
　　腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）屬中醫(yī)“出血性中風(fēng)”范疇。歷史上，通腑法治療中風(fēng)淵源悠久，并曾經(jīng)廣為運(yùn)用。在現(xiàn)代，以王永炎為代表的通腑化痰治療急性期中風(fēng)的學(xué)派影響深遠(yuǎn)。臨床中，ICH病人常發(fā)病即有大便不通(常持續(xù)3～5天，甚至10余天)等腑實(shí)之象。此時(shí)清者不升，濁者不降，氣機(jī)升降乖逆，中焦阻塞不通。腑不通則竅不開(kāi)，熱不去必風(fēng)不熄，平肝潛陽(yáng)降逆諸法揚(yáng)湯止沸緩不濟(jì)急，唯通腑瀉熱一途釜底抽薪

2、最為適宜。應(yīng)用通腑法治療ICH時(shí)以大承氣湯最為常見(jiàn)，但其對(duì)ICH作用的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)確切機(jī)制尚不很明了。
　　炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激是ICH后腦損傷最重要的機(jī)制。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活并獲得吞噬性，以清除血腫及腦組織和紅細(xì)胞壞死時(shí)產(chǎn)生的碎片。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)和釋放促炎性因子，從而加重腦損傷。對(duì)ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活究竟該抑制還是該促進(jìn)的爭(zhēng)議在持續(xù)。另外，對(duì)于如何有效地判斷小膠質(zhì)細(xì)胞是否激活及其程度，以及其形態(tài)、功能改變有否未盡知之規(guī)律

3、等等問(wèn)題，都值得學(xué)界研究。
　　在ICH后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中，Nrf2/Src/MAPKs通路被激活，并對(duì)ICH產(chǎn)生影響。那么，大承氣湯及大黃素對(duì)此是否也有影響？影響如何？闡明這個(gè)問(wèn)題勢(shì)必將對(duì)大承氣湯及大黃素作用機(jī)制做出深刻揭示。
　　目的：
　　對(duì)膠原酶VII誘導(dǎo)ICH模型大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療，研究大承氣湯及大黃素對(duì)ICH的治療作用，及對(duì)Nrf2/Src/MAPKs通路的影響及效應(yīng)，并對(duì)ICH后小膠質(zhì)細(xì)

4、胞激活特點(diǎn)、規(guī)律進(jìn)行探討。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)對(duì)膠原酶VII誘導(dǎo)ICH模型大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療，采用組織化學(xué)、行為學(xué)檢測(cè)、MRI、免疫組化、多重免疫熒光標(biāo)記、免疫印跡等技術(shù)手段對(duì)ICH模型大鼠進(jìn)行觀察及評(píng)價(jià)。
　　ICH模型復(fù)制及其評(píng)價(jià)：對(duì)3月齡SD雄性大鼠腦左側(cè)CPU注射膠原酶VII0.4U，以復(fù)制ICH動(dòng)物模型。通過(guò)MRI結(jié)構(gòu)像、TTC染色、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（平衡木實(shí)驗(yàn)、懸體扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)）及一般情況觀察等方法來(lái)評(píng)價(jià)膠原酶

5、VII注射后3 d時(shí)模型制作效果。
　　大承氣湯、大黃素對(duì)ICH治療作用：對(duì)膠原酶VII注射大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療。觀察大鼠一般情況及體重改變，評(píng)估其整體疾病狀態(tài)及恢復(fù)程度；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（平衡木實(shí)驗(yàn)、懸體扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)）觀察ICH后大鼠一側(cè)肌力改變程度，評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能缺損及恢復(fù)；MRI檢測(cè)血腫體積以評(píng)估ICH后腦組織受損范圍；普魯士藍(lán)染色評(píng)估ICH病理改變及恢復(fù)；MRI波譜檢測(cè)出血區(qū)域腦組織乳酸水平。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞的激活

6、及其規(guī)律：免疫組化（Iba-1）觀察ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及規(guī)律；免疫組化（IL-1β、IL-10）及多重免疫熒光標(biāo)記觀察激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子類(lèi)型及水平；普魯士藍(lán)染色觀察ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鐵的吞噬及鐵沉積，以評(píng)價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能和鐵沉積病理改變。
　　大承氣湯、大黃素對(duì)ICH后Nrf2/Src/MAPKs通路的影響：免疫印跡觀察 Nrf2/Src通路的激活及其對(duì)下游 MAPKs（ERK、JNK、p38）的作用，以及

7、對(duì)促炎性因子（IL-1β、TNF-α）及抗炎性因子（Arg1、IL-10）表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　ICH模型成功復(fù)制膠原酶VII注射后3 d，大鼠一般狀況差，體重下降。TTC染色示造模后左側(cè)CPU局部組織結(jié)構(gòu)被破壞。MRI結(jié)構(gòu)像示造模后3 d時(shí)，左側(cè)CPU出現(xiàn)高信號(hào)區(qū)，提示出血。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)示造模后3 d時(shí)，大鼠因一側(cè)肌力減退而出現(xiàn)異常行為，表現(xiàn)為平衡能力、動(dòng)作協(xié)調(diào)性下降，以及懸體搖擺時(shí)軀體扭轉(zhuǎn)偏向于出血側(cè)即左側(cè)。無(wú)

8、論是整體狀態(tài)，還是行為異常，均提示大鼠在膠原酶VII注射后3 d時(shí)出現(xiàn)類(lèi)似ICH后的臨床表現(xiàn)，而MRI結(jié)構(gòu)像及TTC染色則直接證實(shí)ICH的產(chǎn)生及腦組織結(jié)構(gòu)的破壞。由此肯定，膠原酶VII誘導(dǎo)ICH模型成功。
　　大承氣湯、大黃素對(duì)ICH的治療作用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大承氣湯、大黃素治療后大鼠一側(cè)肌力減退情況顯著改善；普魯士藍(lán)染色結(jié)果表明大承氣湯、大黃素治療后普魯士藍(lán)染色著色程度在ICH后14 d時(shí)達(dá)到峰值，并且其加重趨勢(shì)在28 d時(shí)得

9、到根本扭轉(zhuǎn)（此時(shí)模型組大鼠著色程度加重趨勢(shì)無(wú)改變）；MRI出血灶體積測(cè)定結(jié)果表明大承氣湯、大黃素的治療可以使ICH后出血灶體積減?。ㄅc模型組比較）；一般情況的觀察及體重增加表明大承氣湯、大黃素治療可以促進(jìn)ICH后整體恢復(fù)。
　　ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活 Iba-1染色證明ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞激活， Iba-1/GFAP雙標(biāo)表明小膠質(zhì)細(xì)胞更接近于病變位置，提示ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞的作用可能更早、更快及更重要。同時(shí)發(fā)現(xiàn)ICH后，小膠質(zhì)細(xì)胞

10、聚集于出血區(qū)域及其周?chē)⒃诔鲅爸車(chē)鷧^(qū)域間形成條帶。對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分支條數(shù)、胞體面積的分析發(fā)現(xiàn)兩者均與離出血中心區(qū)域的距離呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)設(shè)計(jì)一種新的分析方法，即小膠質(zhì)細(xì)胞激活系數(shù)分析方法（MAF），我們能對(duì)ICH出血中心及其周?chē)B續(xù)區(qū)域腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)量。利用MAF，發(fā)現(xiàn)在ICH中心區(qū)域邊緣外400μm范圍內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度與其到出血中心區(qū)域邊緣的距離呈直線負(fù)相關(guān)。ICH后，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能均發(fā)生

11、明顯改變，且兩者大致相適應(yīng)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能具有可塑性。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬及分泌功能 Iba-1染色及Iba-1/普魯士藍(lán)雙重染色表明在ICH后，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)入腦的紅細(xì)胞，以及壞死的紅細(xì)胞和腦組織碎片進(jìn)行吞噬。尤其是當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞在出血區(qū)域周?chē)芗纬蓷l帶時(shí)，這種吞噬功能可以限制血腫擴(kuò)大，以及鐵、血紅素等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴(kuò)散。吞噬鐵后，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)鐵過(guò)載，鐵過(guò)載的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)特殊的細(xì)胞行為以實(shí)現(xiàn)鐵卸載。多重免疫

12、熒光標(biāo)記證明ICH3 d時(shí)，出血中心區(qū)域周?chē)せ畹男∧z質(zhì)細(xì)胞主要是M1型，且分泌IL-1β，但幾乎不分泌TNF-α；在ICH后7 d以前，小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活占主導(dǎo)，而在7 d以后，M2型激活占主導(dǎo)。
　　Nrf2/Src/MAPKs通路的激活、效應(yīng)及大承氣湯和大黃素的影響通過(guò)Western Blot檢測(cè)注射側(cè)CPU促/抗炎性因子表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ICH后14 d時(shí)，大承氣湯和大黃素能下調(diào)促炎性因子IL-1β，但不能下調(diào)TNF-α；能

13、上調(diào)抗炎性因子Arg1和/或IL-10；通過(guò)檢測(cè)MAPKs水平，發(fā)現(xiàn)大承氣湯治療后P-ERK/ERK處于高水平，P-JNK/JNK處于低水平，而P-p38/p38水平無(wú)變化；大黃素干預(yù)后此三者均處于高水平。上述效應(yīng)由N rf2/Src通路上調(diào)而引發(fā)，但在ICH后14 d時(shí)，Nrf2和/或Src呈低水平（其原因?yàn)閜38對(duì)Nrf2的下調(diào)和促降解作用）。我們同時(shí)對(duì)注射側(cè)海馬作了觀察，發(fā)現(xiàn)大承氣湯、大黃素的治療可以上調(diào)抗炎性因子Arg1、IL-

14、10分泌水平，下調(diào)促炎性因子TNF-α水平，IL-1β水平無(wú)改變，并下調(diào)p38水平（vs Mod）。
　　結(jié)果歸納：
　　⑴ICH后，大承氣湯和大黃素的治療能加速行為異常的恢復(fù)（即改善神經(jīng)功能缺損）；減小出血灶體積（使更多腦組織受到保護(hù)而幸存）；使鐵沉積病理改變更早開(kāi)始恢復(fù)（從而縮短ICH的病理進(jìn)程）。
　　⑵通過(guò)Nrf2/Src信號(hào)通路的激活，大承氣湯和大黃素的治療可以上調(diào)抗炎性因子Arg1、IL-10（以促進(jìn)ICH

15、后腦組織的修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)）；抑制MAPKs（JNK）而下調(diào)促炎性因子IL-1β（以降低ICH后炎癥反應(yīng)從而減少腦損傷）；Src還促進(jìn)ICH后小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移及吞噬（以限制血腫擴(kuò)大，以及鐵等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴(kuò)散，從而保護(hù)周?chē)X組織）。
　　⑶激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能均發(fā)生明顯改變。其吞噬功能可以限制ICH后血腫的擴(kuò)大，以及鐵、血紅素等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴(kuò)散（從而保護(hù)周?chē)X組織）。
　?、萂AF可以對(duì)ICH出血中心及其周?chē)B續(xù)

16、區(qū)域腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)量。⑸鐵過(guò)載的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鐵卸載時(shí)出現(xiàn)特殊的細(xì)胞行為。
　　結(jié)論：
　?、糯蟪袣鉁痛簏S素的治療對(duì)ICH大鼠具有保護(hù)及促進(jìn)恢復(fù)的作用；
　　⑵該作用是經(jīng)由Nrf2/Src/MAPKs信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)；
　　⑶激活的小膠質(zhì)細(xì)胞具有形態(tài)及功能可塑性，且形態(tài)與功能相適應(yīng)；
　?、燃せ畹男∧z質(zhì)細(xì)胞吞噬功能可以保護(hù)周?chē)X組織；
　?、蒑AF以定量的方式準(zhǔn)確判斷小膠質(zhì)