UTP通過(guò)Ca2+信號(hào)和PTEN通路抑制胃癌的分子機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 P2Y6受體在人胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　目的:
　　觀察P2Y6受體在人胃癌與癌旁正常組織以及胃癌細(xì)胞系與正常胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　方法:
　　采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)P2Y6受體在胃癌組織及癌旁正常組織的蛋白表達(dá)情況，并與臨床病理特征以及病人的生存預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析;qRT-PCR檢測(cè)P2Y6受體在胃癌組織與癌旁正常組織以及癌細(xì)胞系與正常胃黏膜細(xì)胞G

2、ES-1 mRNA水平的表達(dá);Western blot檢測(cè)P2Y6受體在胃癌細(xì)胞系與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P2Y6受體蛋白在胃癌組織的表達(dá)低于癌旁正常組織，而且發(fā)現(xiàn)P2Y6受體在胃癌組織標(biāo)本里面的蛋白表達(dá)值高的，腫瘤小、分化好、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少以及生存時(shí)間長(zhǎng);qRT-PCR結(jié)果顯示P2Y6受體mRNA在胃癌組織的表達(dá)低于癌旁正常組織，在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)低于正常胃黏膜細(xì)胞GES-

3、1的表達(dá);Western blot結(jié)果表明P2Y6受體蛋白在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)低于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　P2Y6受體在人胃癌組織以及胃癌細(xì)胞系中低表達(dá)，提示其在胃癌過(guò)程中可能起到抑癌基因的作用。
　　第二部分 UTP對(duì)胃癌細(xì)胞行為學(xué)的影響
　　目的:
　　研究UTP對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及其體內(nèi)、外生長(zhǎng)的影響。
　　方法:
　　CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UTP、UDP、Sp

4、iperone、CPA、MRS2578、shP2Y6、BAPTA-AM和2-APB對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901增殖的影響;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)UTP、UDP、Spiperone和CPA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901周期的影響;Western blot檢測(cè)UTP、UDP、Spiperone和CPA對(duì)胃癌細(xì)胞Rb的磷酸化和Cyclin D1的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UTP對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901遷移能力的影響;Transw

5、ell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UTP對(duì)MKN-45和SGC-7901及GES-1細(xì)胞侵襲能力的影響;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UTP對(duì)胃癌的體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果:
　　CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UTP、UDP、Spiperone和CPA抑制胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901的增殖，MRS2578、shP2Y6、BAPTA-AM和2-APB能恢復(fù)UTP對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制;流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果表明UTP、UDP、Spiperone和CPA阻滯胃

6、癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞周期在G1期;Western blot顯示UTP、UDP、Spiperone和CPA抑制胃癌細(xì)胞Rb的磷酸化和Cyclin D1的表達(dá);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示UTP抑制胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901的遷移能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)UTP抑制MKN-45和SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力，但不影響正常胃黏膜細(xì)胞GES-1;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UTP抑制胃癌的體內(nèi)生長(zhǎng)，而且可被P2Y6受體拮抗劑以及干

7、擾P2Y6受體所逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　UTP通過(guò)P2Y6受體抑制胃癌的體內(nèi)、外生長(zhǎng)，和抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　第三部分 UTP抑制胃癌細(xì)胞的分子機(jī)制研究
　　第一節(jié)
　　目的:
　　研究UTP抑制胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　方法:
　　單細(xì)胞Cd+成像技術(shù)檢測(cè)UTP、UDP、MRS2578對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響;0Ca2+和2mM Ca2+

8、的時(shí)候，UTP、UTP+U73122、UTP+2-APB，對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響;0Ca2+的時(shí)候，UTP、CPA、Spiperone對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響;0Ca2+的時(shí)候，CPA或者Spiperone刺激之后再用UTP刺激對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響。Western blot檢測(cè)UTP、UDP、Spiperone、UTP+MRS2578以及UTP+2-APB對(duì)β-catenin(Ser675)的影響。
　　結(jié)

9、果:
　　UTP、UDP增加胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901內(nèi)Ca2+水平，MRS2578抑制這一作用;0Ca2+和2mM Ca2+的時(shí)候，UTP都增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，U73122和2-APB都可以抑制這一作用;0Ca2+的時(shí)候，UTP、CPA、Spiperone增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+;0Ca2+的時(shí)候，CPA或者Spiperone刺激增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，再用UTP刺激檢測(cè)不到Ca2+變化的信號(hào)。UTP、UDP、Spiperon

10、e抑制β-catenin(Ser675)的表達(dá)，而MRS2578和2-APB可以逆轉(zhuǎn)這一作用。
　　結(jié)論:
　　1、UTP通過(guò)P2Y6受體引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，UTP引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加是由于內(nèi)Ca2+的釋放及繼發(fā)外Ca2+的內(nèi)流。
　　2、UTP通過(guò)P2Y6受體引起內(nèi)Ca2+增加，抑制β-catenin(Ser675)磷酸化的表達(dá)。
　　第二節(jié)
　　目的:
　　研究UTP抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲

11、的分子機(jī)制。
　　方法:
　　Western blot檢測(cè)PTEN在GES-1和MKN-45以及SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及UTP對(duì)胃癌細(xì)胞PTEN磷酸化水平、Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:
　　PTEN基因在胃癌細(xì)胞MKN-45和SGC-7901的表達(dá)低于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1。UTP上調(diào)了胃癌細(xì)胞內(nèi)PTEN磷酸化水平，抑制了Vimentin蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論: