HDAC1對(duì)分娩啟動(dòng)前后人子宮平滑肌細(xì)胞PR影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　人類的妊娠和分娩是極其復(fù)雜的生理過(guò)程。妊娠子宮平滑肌由靜息轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮收縮狀態(tài)啟動(dòng)分娩，其具體機(jī)制尚不明確，目前仍是臨床研究熱點(diǎn)之一。孕激素是維持妊娠子宮平滑肌處于靜息即舒張狀態(tài)的重要激素，當(dāng)孕激素的這種功能被阻斷后分娩發(fā)生。人類不同于大多數(shù)靈長(zhǎng)類的是分娩啟動(dòng)時(shí)母體血漿孕激素水平并未下降，仍然維持高水平。研究發(fā)現(xiàn)孕激素受體(PR)阻斷劑，例如RU486，卻可以使妊娠子宮收縮導(dǎo)致分娩，于是人們提出了“功能性孕激素撤退”來(lái)解

2、釋人類和部分靈長(zhǎng)類的分娩啟動(dòng)機(jī)制。目前研究認(rèn)為眾多“功能性孕激素撤退”的原因中重要因素之一是:孕激素受體亞型(PRs)表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致子宮對(duì)孕激素敏感性降低。
　　PR基因位于11q22-23，含8個(gè)外顯子，長(zhǎng)度大約90kb，主要有PRA、PRB兩種亞型。PRA基因是PRB的縮短版，其N端缺少164個(gè)氨基酸，PRA、PRB亞型的表達(dá)由來(lái)自于單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的兩個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子控制，因此PRA和PRB功能不同:PRB作為PR基因全長(zhǎng)版本

3、受體，介導(dǎo)孕激素的大多數(shù)作用，比如維系子宮處于靜息狀態(tài)，而PRA則抑制PRB此種功能。近期大量研究表明人類妊娠晚期相對(duì)于PRB，PRA表達(dá)上升，PRA/PRB相對(duì)比值上升進(jìn)而啟動(dòng)分娩，產(chǎn)程開始。然而調(diào)節(jié)PR亞型發(fā)生此種改變的機(jī)制尚不清楚。
　　近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期子宮平滑肌組織，相比于PRB，PRA啟動(dòng)子區(qū)乙酰化水平顯著升高，這給表觀遺傳學(xué)調(diào)控“孕激素功能性撤退”提供一種可能性。組蛋白乙?；ㄟ^(guò)組蛋白乙?；?HATs)和去乙酰

4、化酶(HDACs)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而，具體是那些酶作用于PRA基因啟動(dòng)子，使其乙?；缴呷孕柽M(jìn)一步研究。同時(shí)乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)HDAC，尤其HDAC1，能與雌激素受體(ERα)啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)ER表達(dá)。真核生物根據(jù)序列同源性，HDACs家族分為四大類，主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，少部分種類位于細(xì)胞器。HDACs家族成員結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能各不相同，其中人HDAC1屬于Ⅰ類HDACs成員，和酵母Rpd3/Sdi2/Sds6具有同源性

5、。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)分析臨產(chǎn)孕婦子宮發(fā)現(xiàn)伴隨著PRA表達(dá)升高，HDACsⅠ類成員HDAC1顯著下降。結(jié)合近期國(guó)內(nèi)外研究，我們推測(cè)HDAC1可能參與PR調(diào)控，通過(guò)表觀修飾PR參與分娩發(fā)動(dòng)過(guò)程。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，展開研究。以期初步探索人類分娩啟動(dòng)的表觀遺傳相關(guān)機(jī)制，為早產(chǎn)、過(guò)期產(chǎn)的預(yù)防和治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達(dá)，及PRA/PRB值變化。
　　收

6、集臨產(chǎn)組和未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，提取組織mRNA和核蛋白，行RT-PCR比較兩組標(biāo)本HDAC1、PRA和PRB的mRNA水平，計(jì)算兩組標(biāo)本PRA/PRB值，并western blot檢測(cè)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組三種蛋白的表達(dá)水平。
　　2.分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細(xì)胞(HUtSMCs)
　　取組織塊用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞，并用免疫熒光法和western blot檢測(cè)人妊娠子宮平滑肌蛋白標(biāo)志物:C

7、alponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.構(gòu)建HDAC1干擾(HDAC1-RNAi)質(zhì)粒和HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒
　　英俊公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建沉默HDAC1表達(dá)的HDAC1-RNAi質(zhì)粒和HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。
　　4.HDAC1干擾質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUtSMCs
　　取P4代HUtSMCs，電穿孔法轉(zhuǎn)染HDAC1干擾質(zhì)粒、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒。流式細(xì)胞儀測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

8、。
　　5.檢測(cè)沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化
　　原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后，RT-PCR分析HDAC1、PRA和PRB的mRNA表達(dá)變化，及PRA/PRB比值變化，western blot方法檢測(cè)三個(gè)基因的蛋白水平變化。
　　6.檢測(cè)過(guò)表達(dá)HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化
　　原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)粒后，RT-PCR技術(shù)和western blot方法分析HDAC1、PRA和PRB的m

9、RNA和蛋白表達(dá)變化，及PRA/PRB比值變化。
　　7.HDAC1調(diào)控PRs的機(jī)制研究
　　ChIP分析比較干擾組、過(guò)表組和對(duì)照組HDAC1在PRA、PRB啟動(dòng)子區(qū)富集量。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用GraphPad Prism5軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均先行正態(tài)性檢驗(yàn)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。雙尾Student't檢驗(yàn)比較兩組間差異。
　　結(jié)果：
　　1.比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮

10、平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達(dá)，及PRA/PRB值變化。
　　mRNA水平和蛋白水平分析兩組樣本:(1)臨產(chǎn)組PRA的表達(dá)顯著高于未臨產(chǎn)組;(2)兩組間PRB的表達(dá)水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(3)臨產(chǎn)組PRA/PRB的值明顯高于未臨產(chǎn)組;(4)臨產(chǎn)組HDAC1的水平明顯降低，低于未臨產(chǎn)組。
　　2.分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細(xì)胞(HUtSMCs)
　　倒置顯微鏡下觀察，樣本組織可見典型長(zhǎng)梭形肌纖維;原代細(xì)胞

11、呈長(zhǎng)梭行生長(zhǎng);細(xì)胞免疫熒光法和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大量人子宮平滑肌蛋白標(biāo)志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC于原代細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.HDAC1干擾質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUtSMCs
　　免疫熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀，見實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)大量綠色熒光，測(cè)得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率60％以上。
　　4.檢測(cè)沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化
　　干擾HUtSM

12、Cs的HDAC1表達(dá)，PRA基因的mRNA和蛋白表達(dá)升高;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值升高。
　　5.檢測(cè)過(guò)表達(dá)HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化
　　過(guò)表達(dá)HDAC1，PRA基因的mRNA和蛋白表達(dá)降低;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值下降。
　　6.HDAC1調(diào)控PRs的機(jī)制研究
　　CHIP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾組HDAC1在PRA啟動(dòng)子區(qū)富集量明顯減少;過(guò)表達(dá)組，其HDAC1在PR