人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制及體外擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化策略研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種擁有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在骨髓、脂肪、滑膜、臍帶、肌肉等多種成體組織中都有存在，在特定的條件下可誘導(dǎo)分化為外胚層、中胚層、內(nèi)胚層三個(gè)胚層的多種細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)相比，擁有取材方便、無(wú)免疫排斥反應(yīng)、不存在倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程和再生醫(yī)學(xué)中一種較為理想的種子細(xì)胞

2、。MSCs可以通過(guò)體外直接原代培養(yǎng)的方式獲取，但在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，MSCs會(huì)伴隨出現(xiàn)不可逆的復(fù)制性衰老。具體表現(xiàn)為原代培養(yǎng)的MSCs在傳代8～10代后，細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，生長(zhǎng)變得非常緩慢，自我更新能力下降，失去向各系分化的能力。因而，通過(guò)原代培養(yǎng)而最終能夠用于細(xì)胞治療的MSCs數(shù)量非常有限。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是最早被發(fā)現(xiàn)并研究的間充質(zhì)

3、干細(xì)胞之一。目前對(duì)于BMSCs的研究和報(bào)道都比較多，對(duì)于其用于臨床方面的研究也是MSCs中最早的，因而有望成為最先應(yīng)用于臨床治療的MSCs。BMSCs可通過(guò)全骨髓法和密度梯度離心等方法從骨髓中進(jìn)行原代培養(yǎng)，取材較方便，并可通過(guò)對(duì)其特異性的表達(dá)CD29、CD44、CD105等標(biāo)志物進(jìn)行分離篩選。
　　多能成體祖細(xì)胞(MAPCs)是一種從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離得到的一類(lèi)多能干細(xì)胞，在形態(tài)上MAPCs與早期的ESCs相類(lèi)似，部分細(xì)胞呈現(xiàn)

4、克隆樣生長(zhǎng)，增殖能力和分化能力比MSCs更強(qiáng)，具有類(lèi)似于ESCs的全能分化潛力，可連續(xù)傳代80～120次而不出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。目前有研究認(rèn)為MAPCs是MSCs下的一個(gè)亞型，其培養(yǎng)條件與MSCs基本一致，并能共同表達(dá)CD105、SSEA-3等標(biāo)志物。
　　前期，我們通過(guò)ESCs-MAPCs-MSCs全基因組芯片，篩選到了一批差異基因。其中，我們挑選了在MSCs中高表達(dá)的mRNA prrx1做為研究對(duì)象，該基因編碼的中胚層配對(duì)同源蛋白（

5、paired mesoderm homeobox protein1）是間充質(zhì)的一個(gè)標(biāo)志物，有研究表明prrx1可以直接參與細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，并且能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical mesenchymal stem cells，UMSCs)是從臍帶中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，與BMSCs相比，UMSCs擁有活力更好，增殖能力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。有研究證實(shí)在體外培養(yǎng)過(guò)程中，相同培養(yǎng)代數(shù)的UMSC

6、s的倍增時(shí)間要明顯短于BMSCs，UMSCs細(xì)胞周期G1期與S期的比例要遠(yuǎn)高于BMSCs。
　　外泌體(exosomes)是細(xì)胞分泌的一種微小囊泡，直徑大約在40～100nm之間。外泌體可以特異性的攜帶細(xì)胞所特異表達(dá)的活性物質(zhì)，包括miRNA，mRNA，蛋白質(zhì)等，通過(guò)胞吐與胞吞的方式與其他細(xì)胞通訊連接，傳遞所攜帶的活性物質(zhì)。外泌體作為一種重要的旁分泌手段，可參與影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過(guò)程。目前，已有間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體促

7、進(jìn)其他細(xì)胞增殖的報(bào)道，提示MSCs外泌體內(nèi)可能含有調(diào)控MSCs增殖的關(guān)鍵物質(zhì)。
　　目的:本課題的主要目的在于探索prrx1基因以及早代UMSCs外泌體在影響MSCs增殖中的作用研究，尋找優(yōu)化MSCs的培養(yǎng)體系，籍此來(lái)解決MSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中帶來(lái)的增殖減弱的困擾。
　　第一部分:prrx1基因敲減在促M(fèi)SCs增殖中的作用研究
　　方法:(1)通過(guò)ESCs-MAPCs-MSCs全基因組芯片篩選出在不同增殖能力的干細(xì)胞中

8、差異表達(dá)的基因prrx1。(2)原代培養(yǎng)MSCs，并通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)鑒定其成骨成軟骨成脂肪誘導(dǎo)分化能力。(3)通過(guò)設(shè)計(jì)prrx1的siRNA轉(zhuǎn)染MSCs的方式來(lái)構(gòu)建prrx1表達(dá)降低的體系，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證干擾效率。(4)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖相關(guān)標(biāo)志物ki67的表達(dá)。(5)通過(guò)Edu實(shí)驗(yàn)比較干擾prrx1后Edu摻入水平的差異。(6)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR比較干擾prrx1后多能性相關(guān)基因oct4、sox2、na

9、nog的表達(dá)差異。(7)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR比較干擾prrx1后上皮相關(guān)基因cdh1、epcam和間充質(zhì)相關(guān)基因cdh2、vim的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)原代培養(yǎng)的MSCs可以成功分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，符合MSCs的特征。(2)干擾prrx1基因能夠促進(jìn)MSCs增殖能力，提高增殖相關(guān)標(biāo)志物ki67表達(dá)，并提高Edu摻入比例。(3)干擾prrx1基因能夠促進(jìn)MSCs自我更新能力，促進(jìn)干細(xì)胞多能相關(guān)基因oct4、so

10、x2、nanog的表達(dá)。(4)干擾prrx1基因能夠促進(jìn)上皮相關(guān)基因cdh1、epcam的表達(dá)，但不能降低間充質(zhì)相關(guān)基因cdh2、vim的表達(dá)，且不能使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)上的改變。
　　結(jié)論:prrx1基因是MSCs區(qū)別于MAPCs、ESCs高表達(dá)的基因。干擾prrx1表達(dá)可以促進(jìn)MSCs的增殖能力，提高M(jìn)SCs的自我更新能力。但不能使MSCs發(fā)生MET轉(zhuǎn)化。
　　第二部分:UMSCs早代外泌體在促BMSCs增殖中的作用研究

11、>　　方法:(1)原代培養(yǎng)UMSCs，用超速離心法收集早代UMSCs的外泌體（第二代和第三代）(2)通過(guò)納米粒子分析系統(tǒng)和微流式成像系統(tǒng)對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。(3)通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、Edu實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入P2和P3代外泌體后BMSCs增殖能力的改變。
　　結(jié)果:(1)納米粒子分析系統(tǒng)和微流式成像系統(tǒng)證實(shí)超速離心法得到的外泌體在大小上和能夠表達(dá)特異標(biāo)志物方面符合外泌體的描述。(2)P2代外泌體可以促進(jìn)BMSCs的增殖，增加細(xì)胞

12、周期S期的比例，提高Edu的摻入率，增加細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)論:超速離心法是一種簡(jiǎn)單有效的提取外泌體的方法。UMSCs早代的外泌體可以促進(jìn)BMSCs的增殖能力，并且促進(jìn)BMSCs增殖的活性物質(zhì)可能存在于第二代UMSCs的外泌體中。
　　第三部分: P2代外泌體中的促增殖成分鑒定與功能研究
　　方法:(1)將收集的P2代及P3代外泌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)銀染結(jié)果選擇差異亮度的條帶送于蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行

13、生物信息學(xué)分析。(2)將收集的P2代及P3代外泌體送于細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片，選取差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(3)對(duì)選取出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(4)通過(guò)Edu實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在加入P2代UMSCs外泌體的同時(shí)加入CCR2抑制劑，對(duì)BMSCs Edu摻入水平的改變。
　　結(jié)果:(1)質(zhì)譜結(jié)果顯示外泌體中絕大部分成分是角蛋白和微管蛋白。(2)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片篩選出了P2代中高表達(dá)的增殖相關(guān)的蛋白CCR1和CCR2。(3)