E-cadherin介導(dǎo)的麥冬皂苷B調(diào)控非小細(xì)胞肺癌Hippo通路的機制研究.pdf

1、[研究背景與目的]:
　　隨著對腫瘤發(fā)病機制認(rèn)識的逐步深入，靶向調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的信號通路已在惡性腫瘤的治療中占據(jù)重要地位。Hippo信號通路是近年來研究發(fā)現(xiàn)的能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡，調(diào)控細(xì)胞、組織生長的一個高度保守的生長控制信號通路。YAP和TAZ是其關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，非磷酸化狀態(tài)的YAP可以轉(zhuǎn)移入核，與TEAD/TEF家族和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的

2、作用，最終影響器官的大小以及腫瘤的形成。大量研究證實，Hippo通路在腫瘤進(jìn)程中扮演了重要角色。“周氏克金巖方”（來自國醫(yī)大師周仲瑛教授）為臨床抗肺癌的有效驗方。課題組前期對該方已經(jīng)展開了系列的研究，動物實驗結(jié)果顯示，該方能顯著抑制裸鼠移植瘤生長。并且通過藥化分離及高通量平臺篩選，從該方中獲取到了一批細(xì)胞毒性成分。分析發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷類化合物具有顯著地抗腫瘤效應(yīng)。針對抗癌效果較好的麥冬皂苷B（Ophiopogonin B，OP-B）做進(jìn)一

3、步研究，分析發(fā)現(xiàn)其對Hippo通路的交叉網(wǎng)絡(luò)有顯著調(diào)節(jié)作用。因此，本研究試圖發(fā)現(xiàn)和闡明OP-B在調(diào)控Hippo通路及其系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的作用，為其臨床腫瘤治療提供強有力的實驗依據(jù)。
　　[實驗內(nèi)容]:
　　本文以發(fā)病率及死亡率居首位的非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)為病理模型，剖析OP-B對Hippo通路的調(diào)控作用。第一部分以YAP為指標(biāo)考察OP-B對Hippo通路是否有調(diào)節(jié)作用。第二

4、部分對可能與OP-B作用相關(guān)的Hippo通路的交叉網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，最終選擇E-cadherin及其相關(guān)連接蛋白進(jìn)行研究，利用Westernblot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀實驗及siRNA干擾等技術(shù)探究其在OP-B調(diào)節(jié)YAP、發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的關(guān)系。第三部分則通過siRNA干擾實驗和過表達(dá)實驗最終驗證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的重要地位。
　　[研究結(jié)果]:
　　第一部分:我們利用Westernblot檢測

5、藥物對YAP和p-YAP(Ser127)蛋白表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴性地促進(jìn)YAP的Ser127磷酸化蛋白的生成。細(xì)胞免疫熒光實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)OP-B能降低YAP入核細(xì)胞百分比。說明OP-B能抑制YAP的活化，促進(jìn)YAP的Ser127磷酸化，限制YAP的入核。第二部分:為了研究E-cadherin是否參與OP-B的抗腫瘤作用的發(fā)揮，我們分別通過誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)和抑制E-cadherin的功能后檢測OP-B對細(xì)胞活力

6、的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)E-cadherin的合成，OP-B對NCI-H460細(xì)胞增殖能力的抑制作用增強，而抑制E-cadherin的功能明顯削弱了OP-B對NCI-H460細(xì)胞增殖能力的抑制作用。說明E-cadherin參與OP-B的抑制細(xì)胞增殖作用。而且發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴性地促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制β-catenin的表達(dá)，但是對α-catenin蛋白表達(dá)水平無明顯作用。進(jìn)一步通過免疫共沉淀實驗、β-catenin s

7、iRNA干擾實驗等發(fā)現(xiàn)，OP-B劑量依賴性地促進(jìn)β-catenin與E-cadherin的結(jié)合;干擾β-catenin蛋白的表達(dá)后，YAP的Ser127磷酸化水平明顯降低，YAP核內(nèi)大量聚積，且阻斷了OP-B的促進(jìn)YAP磷酸化的作用。第三部分:通過LATS1 siRNA干擾實驗和構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)YAP細(xì)胞株檢測OP-B對YAP及NCI-H460細(xì)胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與干擾β-catenin的表達(dá)效應(yīng)類似，干擾LATS1蛋白的表達(dá)后，阻斷

8、了OP-B的促進(jìn)YAP磷酸化的作用，且過表達(dá)YAP削弱了OP-B的抑制細(xì)胞增殖作用。進(jìn)一步驗證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的重要作用。
　　[結(jié)論與意義]:
　　本研究結(jié)果表明，OP-B通過促進(jìn)β-catenin與E-cadherin的結(jié)合，傳遞調(diào)控Hippo通路的信號，抑制YAP的活化，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，限制其核內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、抗腫瘤作用。研究中我們探討了E-cadherin與Hip