S100A9過表達(dá)在急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60對化療藥物耐藥作用中的研究.pdf

1、第一部分、S100A9慢病毒載體的構(gòu)建以及慢病毒的包裝
　　目的：構(gòu)建S100A9慢病毒載體并包裝慢病毒顆粒，為該基因在AML對化療藥物耐藥作用中的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：以正常人BMMC cDNA為模板，克隆出S100A9全長cDNA并裝載入pMD19-T載體中后，挑選出陽性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定。將測序正確的陽性克隆中的S100A9片段裝載入目的載體pLVX-IRES-puro中，篩選陽性克隆后進(jìn)行 PCR、

2、雙酶切及測序鑒定。利用磷酸鈣沉淀法，將過表達(dá)載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別收集24h和48 h的病毒上清。收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞，western blot檢測細(xì)胞中S100A9的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：克隆出的S100A9片段與pMD19-T載體連接后的陽性克隆，經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證條帶大小與目的條帶大小幾乎一致。挑選其中的五個(gè)克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示插入片段的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中S100A9的mRNA序列10

3、0％匹配。將測序正確的克隆中的片段插入目的載體pLVX-IRES-puro中，陽性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測序驗(yàn)證均與欲克隆的S100A9片段大小和序列100%匹配。收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)：與轉(zhuǎn)染了空載體細(xì)胞中S100A9的蛋白含量相比，轉(zhuǎn)染了過表達(dá)載體細(xì)胞中S100A9的蛋白表達(dá)量顯著增加。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建S100A9慢病毒載體，并且包裝出慢病毒顆粒。
　　第二部分、S100A9過表達(dá)可以引起急性髓細(xì)胞性

4、白血病細(xì)胞株HL-60的選擇性耐藥
　　目的：研究S100A9過表達(dá)是否可以引起AML細(xì)胞株HL-60對臨床常規(guī)化療藥物（柔紅霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿）的耐藥。
　　方法：利用慢病毒顆粒感染細(xì)胞并用嘌呤霉素藥物篩選的方式，建立S100A9穩(wěn)定過表達(dá)AML細(xì)胞株HL-60/S100A9，以及空載體HL-60/pLVX對照細(xì)胞株。四種臨床常規(guī)化療藥物柔紅霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿以依次遞增的濃度分別

5、處理這兩組細(xì)胞24h后，使用CCK8檢測細(xì)胞活性。對照細(xì)胞的四種化療藥物的IC50分別處理兩組細(xì)胞24h后，使用凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。以IC25和IC50分別處理兩組細(xì)胞后，使用western blot檢測藥物處理前后細(xì)胞中c-PARP的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:外源性S100A9整合進(jìn)入HL-60細(xì)胞的基因組DNA中，同時(shí)HL-60/S100A9細(xì)胞中S100A9在mRNA和蛋白水平都顯著增高。HL-60/S100A9細(xì)胞經(jīng)過柔

6、紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷三種化療藥物處理后，細(xì)胞活性未受影響；但是高三尖杉酯堿顯著抑制了細(xì)胞活性，與對照細(xì)胞相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。柔紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷藥物處理兩組細(xì)胞后，HL-60/S100A9組的凋亡細(xì)胞比率顯著低于HL-60/pLVX組；然而高三尖杉酯堿處理后，兩組凋亡細(xì)胞比例沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，HL-60/S100A9細(xì)胞中c-PARP蛋白在前三種藥物處理后沒有顯著的改變；但是在高三尖杉酯堿處理后，蛋白表達(dá)呈現(xiàn)正向劑量依

7、賴性。
　　結(jié)論：S100A9的高表達(dá)可以引起AML細(xì)胞株HL-60對臨床常規(guī)化療藥物柔紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷的顯著耐藥，從而預(yù)示AML疾病對治療效果反應(yīng)不良。S100A9過表達(dá)的AML細(xì)胞株HL-60對高三尖杉酯堿敏感。
　　第三部分、S100A9過表達(dá)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60對Mcl-1抑制劑敏感
　　目的：進(jìn)一步研究S100A9引起AML細(xì)胞株HL-60對臨床常規(guī)化療藥物耐藥的分子機(jī)制，并探索解決S

8、100A9引發(fā)化療藥物耐藥的途徑。
　　方法:對HL-60/pLVX和HL-60/S100A9兩組細(xì)胞分別進(jìn)行RNA-Seq測序。對測序分析挑選出的候選基因進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。使用Mcl-1小分子抑制劑YM-155處理細(xì)胞后，分別用MTT法檢測細(xì)胞的活性以及western blot檢測藥物處理前后Mcl-1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：RNA-Seq結(jié)果顯示，S100A9和Mcl-1的表達(dá)量在HL-60/S100A9中顯著增高。以

9、HL-60/pLVX為對照細(xì)胞，抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2在HL-60/S100A9中表達(dá)量顯著增高。經(jīng)過四種化療藥物（DNR、VP-16、Ara-C和HHT）處理后，Bcl-2的蛋白表達(dá)量在兩組細(xì)胞中均未發(fā)生改變。經(jīng)過 DNR、VP-16和Ara-C三種藥物處理后，Mcl-1的蛋白表達(dá)量在兩組細(xì)胞中也未發(fā)生改變；然而經(jīng)過HHT處理后，Mcl-1的表達(dá)量在兩組細(xì)胞中均顯著降低。Mcl-1小分子抑制劑YM-155分別處理兩組細(xì)胞后，