脂筏對GABA-,B-受體的調(diào)控機(jī)制研究和GABA-,B-受體活性熒光探針開發(fā).pdf

1、脂筏作為細(xì)胞膜上信號傳導(dǎo)的平臺目前受到越來越多的關(guān)注，尤其是大量的研究已經(jīng)顯示脂筏對G蛋白偶聯(lián)受體功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與G蛋白偶聯(lián)的GABAB受體定位之脂筏結(jié)構(gòu)中，所以探究脂筏對GABAB受體的影響對揭示GABAB受體的調(diào)控機(jī)制具有新的啟示作用。
　　 在本研究中，運(yùn)用單點(diǎn)追蹤技術(shù)追蹤在異源HEK293細(xì)胞中實(shí)時(shí)追蹤GABAB受體在細(xì)胞膜上擴(kuò)散運(yùn)動，發(fā)現(xiàn)GABAB受體的擴(kuò)散特性主要由GABAB2亞基決定。更

2、進(jìn)一步的，蔗糖密度梯度分析受體在脂筏中的定位顯示GABAB2亞基對受體擴(kuò)散特性的決定作用取決于該亞基對受體在脂筏中定位的主導(dǎo)作用。因此，脂筏對限制GABAB受體的側(cè)向擴(kuò)散具有關(guān)鍵的作用。
　　 但是，GABAB受體同脂筏的偶聯(lián)并不是固定不變的。在HEK293細(xì)胞中，激動劑GABA能顯著的提高GABAB受體的擴(kuò)散系數(shù)，這與采用甲基-β-環(huán)糊精 (Methyl-β-cyclodextrin，MCD)破壞脂筏的效應(yīng)相似。與受體擴(kuò)散特性

3、的變化相對應(yīng)，共聚焦成像觀測受體定位和蔗糖密度離心分析GABAB的梯度分布顯示，在異源細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中GABAB受體激活之后在脂筏中的定位程度顯著下降。所有結(jié)果共同說明激活GABAB受體會誘導(dǎo)受體轉(zhuǎn)移出脂筏區(qū)域。
　　 隨著GABAB受體脂筏中定位程度的降低，受體所介導(dǎo)的G蛋白依賴的信號通路激活強(qiáng)度被削弱，例如下游Gi/o介導(dǎo)的ERK (Extracellular signal-regulated protein kinase

4、s)磷酸化程度降低和Gqi9融合蛋白介導(dǎo)的IP3 (InositoL-1,4,5-trisphosphate)的產(chǎn)量減少，這些結(jié)果突顯了脂筏正向促進(jìn)GABAB受體介導(dǎo)的G蛋白信號通路的重要作用。另外，脂筏還能協(xié)助調(diào)控參與GABAB受體信號網(wǎng)絡(luò)的信號分子的時(shí)空組織。信號分子隨著活性的改變進(jìn)入或者離開脂筏區(qū)域，從而決定了信號傳遞動態(tài)的啟動和關(guān)閉。我們的研究掀開了從脂筏的角度詮釋GABAB受體在細(xì)胞膜上動態(tài)行為和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新視野，GABAB受

5、體的這種定位特性非常值得重視。
　　 為了在活細(xì)胞中直接觀測GABAB受體在細(xì)胞膜上的活性和功能并且直接在活細(xì)胞中標(biāo)記GABAB受體，基于GABAB受體高親和力的拮抗劑CGP64213的結(jié)構(gòu)，本研究設(shè)計(jì)、合成并全面評價(jià)了一種活性導(dǎo)向的特異性標(biāo)記細(xì)胞膜上GABAB受體的小分子熒光探針即探針1。探針1由三個(gè)功能基團(tuán)構(gòu)成，即靶向定位基團(tuán)、光親和基團(tuán)、熒光標(biāo)記基團(tuán)。探針可以用于光親和性的標(biāo)記在CHO細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的GABAB受體。此外，