基于親和力質(zhì)譜分析的藥物篩選方法學(xué)研究及應(yīng)用.pdf

1、在新藥研發(fā)的初期階段，藥物快速篩選技術(shù)為新型先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)做出了重要貢獻。目前，基于親和力選擇原理的質(zhì)譜分析技術(shù)（ASMS)，由于其實驗手段、分析方法不依賴于讀取蛋白生物作用，因而在先導(dǎo)化合物的篩選中較傳統(tǒng)技術(shù)更具優(yōu)越性。然而，現(xiàn)階段已報道的ASMS方法各有優(yōu)劣，適用于各類蛋白配體篩選的通用方法未被建立。因此，為滿足藥物研發(fā)進程中的各種需求，加速先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，需要對藥物篩選方法保持持續(xù)性的開發(fā)與優(yōu)化。本博士課題主要通過對基于超過濾

2、(UF)、超離心(UC)原理的兩種ASMS方法進行開發(fā)、優(yōu)化與應(yīng)用，以促進ASMS方法學(xué)的發(fā)展、并擴展其在藥物研發(fā)進程中的應(yīng)用。
　　在第一部分工作中，我們使用文獻已報道的糖尿病靶點蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制劑作為小分子模型，通過對比UF-ASMS和體外酶活性方法分別得到的親和力強度與抑制性強弱的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其具有一致性，證明了 UF-ASMS法的可行性。UF-ASMS法具有高靈敏度、高選擇性、速度快、條件溫和、應(yīng)用范

3、圍廣等優(yōu)點，尤其適用于先導(dǎo)化合物的初步篩選。因此，我們運用該方法從2000個化合物中快速篩選出了與蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)具有結(jié)合能力的化合物。另外，我們使用UF-ASMS方法，在不進一步分離天然紅曲提取物的前提下，篩選、鑒定了其中具有PTP1B選擇性結(jié)合能力的單體，驗證了 UF-ASMS方法能夠適用于在未經(jīng)分離的前提下快速、準(zhǔn)確的篩選天然產(chǎn)物中具有特異性靶點活性的單體，從而有效規(guī)避了傳統(tǒng)分離、分析方法易造成的活性成份丟失、變

4、性等問題；加速對廣泛存在于天然產(chǎn)物中的未知化合物的活性研究；對我國中藥現(xiàn)代化研究進程起到重要推動作用。
　　在第二部分工作中，我們驗證了 UC-ASMS方法能有效規(guī)避普遍存在于UF-ASMS方法中的膜效應(yīng)，且其蛋白及化合物的用量需求較UF-ASMS方法大大降低，但速度與后者相比較慢。隨后，我們應(yīng)用UC-ASMS方法再次篩選該2000個化合物中具有潛在PTP1B抑制活性的化合物，發(fā)現(xiàn)通過兩種方法得到的親和力結(jié)果具有較強的相關(guān)性，且與

5、體外酶活性方法所得的抑制性結(jié)果高度一致，說明了UC-ASMS與UF-ASMS是兩種可相互驗證的互補技術(shù)，能夠有針對性的為不同篩選需求提供合適且可靠的實驗手段。
　　另外，針對目前建立的ASMS方法無法對多靶點結(jié)合配體進行篩選，我們設(shè)計了一種基于密度梯度離心的多靶點同時篩選方法。在該方法中，通過離心力作用使不同分子量的蛋白與化合物在具有濃度梯度的離心介質(zhì)中根據(jù)分子大小進行重新分布、有效分離。最后，通過比對化合物與蛋白離心后的分布情況