磁珠和熒光編碼微球標(biāo)記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、目的：
　　血型鑒定是保證輸血安全的關(guān)鍵手段，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的血型系統(tǒng)、血型抗原被證實(shí)與輸血安全密切相關(guān)，對(duì)更多的抗原靶標(biāo)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定可進(jìn)一步提高個(gè)性化醫(yī)療服務(wù)水平。然而，目前臨床使用的血清學(xué)方法只能進(jìn)行單個(gè)血型抗原靶標(biāo)檢測(cè)，更多血型抗原數(shù)量的分析將顯著增加檢測(cè)時(shí)間并提高人力和經(jīng)濟(jì)成本。為此，本研究分別基于固相微陣列技術(shù)與液相微陣列技術(shù)，利用其高通量優(yōu)勢(shì)，同時(shí)結(jié)合磁珠和熒光編碼微球的標(biāo)記技術(shù)，分別探索了磁珠標(biāo)記的微

2、陣列血型鑒定技術(shù)和熒光編碼微球標(biāo)記的血型鑒定技術(shù)，以達(dá)到快速檢測(cè)多個(gè)血型抗原的目的。
　　方法：
　　磁珠標(biāo)記的微陣列血型鑒定技術(shù)中，使用的反應(yīng)基片經(jīng)過醛基多聚分子修飾，在基片表面形成具有三維結(jié)構(gòu)的醛基聚合物，可以偶聯(lián)抗體蛋白分子。檢測(cè)前先用Tris-HCl(pH=7.3～7.5)裂解紅細(xì)胞標(biāo)本，并將0.2μl處理后的待測(cè)標(biāo)本加在固定有抗體探針的樣點(diǎn)上，隨后用0.2μl磁珠標(biāo)記的C1q識(shí)別抗原抗體復(fù)合物，最后在磁力吸附下將未

3、結(jié)合的磁珠清除。在定量分析中，對(duì)每個(gè)微陳列檢測(cè)點(diǎn)攝影后，用Photoshop進(jìn)行圖像分析識(shí)別信號(hào)強(qiáng)度。
　　經(jīng)技術(shù)改進(jìn)，在傳統(tǒng)的液相微陣列技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光編碼微球標(biāo)記技術(shù)，探索了熒光編碼微球標(biāo)記的微陣列技術(shù)。技術(shù)中，用熒光編碼微球標(biāo)記血型抗體，同時(shí)用磁珠標(biāo)記血凝素分子。檢測(cè)時(shí)，在100μl生理鹽水中加入5μl熒光編碼微球標(biāo)記抗體、1μl的全血標(biāo)本以及5μl磁珠標(biāo)記的血凝素分子;反應(yīng)后進(jìn)行磁分離，最后用Luminex熒光編碼

4、微球檢測(cè)儀對(duì)上清中的微球進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，通過比較每種微球的相對(duì)數(shù)量來判斷血型抗原的結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　磁珠標(biāo)記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)中需要保持反應(yīng)環(huán)境的濕潤，以含有40％甘油的PBS作為反應(yīng)介質(zhì)，能有效避免咖啡環(huán)的形成，使C1q分子識(shí)別抗原抗體復(fù)物的反應(yīng)能正常進(jìn)行。以EDAC、NHS做為偶聯(lián)劑，C1q分子能較好的包被子磁珠表面。當(dāng)抗體探針濃度在100μg/ml，上樣量0.2μl，同時(shí)每個(gè)樣點(diǎn)所需的待測(cè)標(biāo)本量0

5、.2μl時(shí)（約105個(gè)RBCs）其檢測(cè)效果較好。磁分離時(shí)，磁針長度需要控制在4～6 cm，完成檢測(cè)需要10～20分鐘的反應(yīng)時(shí)間。通過對(duì)108個(gè)血液標(biāo)本的分析鑒定，表明A、B、D、M、N五種抗原的敏感度分別為93.18％、83.72％、92.39％、93.24％、90.36％，特異性均為100.00％。
　　熒光編碼微球標(biāo)記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，100萬個(gè)微球與抗體偶聯(lián)后A、B、D、M、N五種抗體的下降量分別為0.17、0

6、.61、0.40、0.31和0.94μg，對(duì)應(yīng)單個(gè)微球表面偶聯(lián)的抗體分子數(shù)量分別約為10萬、38萬、160萬、140萬和377萬個(gè)。反應(yīng)檢測(cè)需要將每種熒光微球的數(shù)量控制在2000～10000之間，紅細(xì)胞數(shù)量106個(gè)左右，對(duì)應(yīng)數(shù)量比為1∶100～20，可以在2 min以內(nèi)完成檢測(cè)。通過對(duì)276例臨床標(biāo)本的A、B、D、M、N血型抗原的分析鑒定，技術(shù)的靈敏度與特異性均可達(dá)到100％，對(duì)長期保存后的血液標(biāo)本以及1+的弱凝集標(biāo)本也有同樣的檢測(cè)效果