人參皂苷Rd對(duì)成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、長(zhǎng)期以來(lái)，神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域都認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元屬于終末分化細(xì)胞，很難再進(jìn)行分裂和增殖。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失及神經(jīng)元的損傷難以得到自我修復(fù)，神經(jīng)功能的重建被視為不可能?？茖W(xué)家們對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分離培養(yǎng)和增殖的成功，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和功能重建帶來(lái)了新的希望。但目前已有的促進(jìn) NSCs增殖和分化的方法都因其臨床治療可操作性不強(qiáng)而制約了臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。因此找到一種促進(jìn) NSCs增殖和定向分化的藥物可能

2、為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供新的可行途徑。人參皂苷 Rd（GSRd）是從人參和三七中提取的一種單體化合物，是它們主要活性成分之一。我們前期的臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，GSRd具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用：治療腦梗死安全有效、減少腦缺血模型大鼠梗死體積、減少神經(jīng)元死亡、促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)等。但 GSRd是否能促進(jìn)成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi) NSCs的神經(jīng)發(fā)生從而發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)功能呢？目前還鮮有報(bào)道。為此本研究擬在在體和離體探究 GSRd對(duì) NSCs增殖及分化的

3、作用并初步探索可能的分子機(jī)制。
　　第一部分GSRd對(duì)成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究
　　目的：探究 GSRd對(duì)海馬齒狀回 NSCs增殖分化的影響。
　　方法：（1）30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠體內(nèi)，每天注射1次，連續(xù)注射1周。GSRd給藥后的第7 d和第14 d處死大鼠，將海馬區(qū)切片，通過(guò) BrdU染色、DCX染色，觀察GSRd對(duì)海馬區(qū) NSCs增殖和新生神經(jīng)元的影響。（2）GSRd給藥后的

4、第34 d處死大鼠，將海馬區(qū)切片，進(jìn)行 BrdU/NeuN和 BrdU/GFAP熒光雙標(biāo)記染色，觀察 GSRd對(duì)海馬區(qū) NSCs分化的影響。
　　結(jié)果：（1）GSRd干預(yù)后7 d，GSRd組的海馬齒狀回BrdU和 DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；GSRd干預(yù)后14 d，GSRd組海馬區(qū) BrdU和 DCX陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。（2）GSRd組的BrdU+/NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞與對(duì)照組相比，數(shù)量明顯增加（

5、P＜0.05）。但兩組BrdU+/NeuN+雙標(biāo)記細(xì)胞占總 BrdU+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，對(duì) GSRd組和對(duì)照組進(jìn)行 BrdU/GFAP免疫熒光雙標(biāo)記染色，兩組均沒(méi)有觀察到 BrdU+/GFAP+雙標(biāo)記細(xì)胞。
　　結(jié)論：GSRd顯著增加海馬齒狀回 NSCs及新生神經(jīng)元的數(shù)量，但對(duì)NSCs的分化并無(wú)明顯作用。
　　第二部分GSRd對(duì)培養(yǎng) NSCs增殖分化影響的研究
　　目的：探究 GSRd對(duì)體外培養(yǎng) NSCs增

6、殖分化的影響。
　　方法：（1）分離培養(yǎng)胎鼠 NSCs并進(jìn)行神經(jīng)球鑒定和分化鑒定。（2）體外培養(yǎng) NSCs，經(jīng)過(guò)不同濃度 GSRd干預(yù)后，觀察神經(jīng)球的數(shù)量和大小的變化；CCK-8法、BrdU免疫熒光染色分別觀察GSRd對(duì) NSCs存活和增殖的影響。（3）體外培養(yǎng) NSCs，經(jīng)過(guò) GSRd干預(yù)后，分別進(jìn)行 Tuj-1、GFAP和 CNPase免疫熒光染色，觀察 GSRd對(duì) NSCs分化的影響。
　　結(jié)果：（1）對(duì)體外培養(yǎng)的NS

7、Cs進(jìn)行 Nestin、Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示被染色的細(xì)胞呈 Nestin陽(yáng)性和 Ki67陽(yáng)性反應(yīng)。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的NSCs可以定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞，具有多向分化的潛能。（2）與對(duì)照組相比，GSRd組神經(jīng)球的數(shù)目和直徑明顯增加（P＜0.05）；CCK-8法、BrdU免疫熒光染色結(jié)果顯示，GSRd可明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs的存活和增殖（P＜0.05

8、）。（3）體外培養(yǎng)的NSCs，GSRd處理組 Tuj-1、GFAP和 CNPase陽(yáng)性細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：GSRd可促進(jìn)體外培養(yǎng) NSCs存活和增殖，對(duì)體外培養(yǎng) NSCs的分化無(wú)影響。
　　第三部分GSRd促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生機(jī)制的研究
　　目的：探究 GSRd促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生可能的分子機(jī)制。
　　方法：（1）Western Blot測(cè)定 GSRd干預(yù)后的NSCs中 Akt、p-

9、Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表達(dá)水平；（2） Western Blot測(cè)定 PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑 LY294002、MAPK/ERK1/2信號(hào)通路抑制劑 PD98059干預(yù)下經(jīng) GSRd作用的NSCs中 Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)；（3） CCK-8法、BrdU免疫熒光染色分別觀察LY294002和 PD98059干預(yù)下經(jīng) GSRd作用的NSCs的存活和增殖。
　　結(jié)果：（1）與

10、對(duì)照組相比，GSRd組 p-Akt、p-ERK蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），但 Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。（2）與 GSRd組相比， LY294002干預(yù)組和 PD98059干預(yù)組 p-Akt、p-ERK蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。（3）LY294002和 PD98059可明顯減弱 GSRd干預(yù)的NSCs的存活和增殖（P＜0.05）。
　　結(jié)論：GSRd可能通過(guò) PI3K/Akt和 M