埃及伊蚊yellow基因家族表達譜分析及rAa-Yc蛋白的功能初探.pdf

1、目的：篩選并鑒定埃及伊蚊（Aedes aegypti）全基因組中yellow基因，分析其基因結(jié)構(gòu)、基因進化以及在不同發(fā)育時期和不同組織的表達譜。并針對Aa-Yc作為研究對象，通過重組表達以獲取rAa-Yc活性蛋白，并對其可能的功能進行初步探索，為進一步探討其在病原與蚊蟲宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:運用模式昆蟲黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）Dm-yellow基因（GenBank No.AAF454

2、97）的王漿主蛋白（Major royal jelly protein，MRJP）結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，在埃及伊蚊全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選并鑒定埃及伊蚊yellow基因家族，采用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy）在線相關(guān)工具包分析其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域，運用SignalP4.1預測信號肽，結(jié)合使用DNAstar、MEGA6.0和GeneDoc軟件包進行同源性比對、保守性分析及進化樹構(gòu)建。提取埃及伊蚊總RNA，合成cDNA，利用熒

3、光實時定量PCR（qRT-PCR）法對埃及伊蚊不同發(fā)育時期（卵、Ⅰ～Ⅳ齡幼蟲、蛹以及未吸血雌蚊和雄蚊）和未吸血雌蚊不同組織（唾液腺、中腸、脂肪體和卵巢）的表達譜進行相對定量分析，并構(gòu)建Aa-Yc基因在埃及伊蚊吸血后唾液腺中的階段性表達譜（飽血0時、飽血24h）。從Vecterbase上埃及伊蚊基因組數(shù)據(jù)庫中獲取埃及伊蚊唾液腺黃蛋白Aa-yellow-c（Aa-Yc）（GenBank No.EAT40936）的全長序列，利用ExPASy中

4、有關(guān)基因和蛋白序列的分析工具，分析預測該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能；設(shè)計基因特異性引物采用RT-PCR技術(shù)從埃及伊蚊（廣東電白株）雌蚊體內(nèi)擴增Aa-Yc基因成熟肽序列，并將其克隆到原核表達質(zhì)粒pEasy-E1和真核表達質(zhì)粒pMT/Bip/V5-HisA。原核表達重組質(zhì)粒pEasy-E1-Aa-Yc在大腸桿菌Rosetta(DE3)中經(jīng)用異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，表達產(chǎn)物用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

5、和免疫印跡（western blotting）鑒定。鎳柱純化后的rAa-Yc經(jīng)皮下注射免疫新西蘭大白兔制備重組抗體，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測抗體效價。真核表達重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-Aa-Yc和篩選載體pCoHygro經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)染入果蠅S2細胞，經(jīng)潮霉素B壓力篩選建立穩(wěn)定表達Aa-Yc的S2細胞系。采用手工法檢測rAa-Yc對人全血部分凝血酶原時間（prothrombin time，PT）,凝血酶時間（throm

6、bin time，TT）及凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）的影響；血小板聚集儀檢測rAa-Yc對二磷酸腺苷（denosine diphosphate，ADP）誘導的人血小板聚集功能的影響。
　　結(jié)果：從埃及伊蚊全基因組中篩選出12條yellow基因（Aa-yellow、Aa-yellow-b、Aa-yellow-c、Aa-yellow-d、Aa-yellow-e、

7、Aa-yellow-f2、Aa-yellow-fb、Aa-yellow-fc、Aa-yellow-g、Aa-yellow-g2、Aa-yellow-h和Aa-yellow-x）。生物信息學分析結(jié)果顯示，12條yellow基因均具有MRJP結(jié)構(gòu)域和信號肽序列。同源性比對結(jié)果顯示，埃及伊蚊yellow基因家族成員間相似性較低，為15％~49%；但其保守域間同源性較高，可達60%。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，12個YELLOW蛋白分為5個亞家族，

8、其中11個在黑腹果蠅中均有直系同源蛋白存在。qRT-PCR結(jié)果顯示，Aa-yellow-d和Aa-yellow-x在雄蚊中高表達（P<0.01或P<0.05）；Aa-yellow-fc在雌蚊和唾液腺中特異高表達（P<0.01）；Aa-yellow-f2在2齡幼蟲中特異高表達（P<0.01）；Aa-yellow、Aa-yellow-e和Aa-yellow-fb在3齡幼蟲中特異高表達（P<0.01）；Aa-yellow、Aa-yellow-

9、e、Aa-yellow-f2、Aa-yellow-fb、Aa-yellow-h和Aa-yellow-x等6條基因在卵巢中高表達（P<0.01或P<0.05）；除Aa-yellow-c和Aa-yellow-x，其余基因幾乎不在中腸表達；其中Aa-Yc（Aa-yellow-c）在Ⅰ齡幼蟲時期高表達，在不同組織中無統(tǒng)計學差異，在蚊蟲吸血后的唾液腺中表達量顯著上調(diào)。Aa-Yc序列全長1852 bp，1～1287位為開放閱讀框，N端含有一個由27

10、個氨基酸組成的信號肽，生物信息學分析顯示其具有MRJP結(jié)構(gòu)域。RT-PCR擴增獲得其成熟肽基因，將其克隆入pEasy-E1載體，經(jīng)PCR及DNA測序證實pEasy-E1-Aa-Yc重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果顯示，成熟肽基因長1200bp，編碼399個氨基酸，等電點為4.67。將測序結(jié)果與原始序列比對顯示獲取的轉(zhuǎn)錄本第86位核苷酸由T（胸腺嘧啶）突變成C（胞嘧啶），導致第29個氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌

11、Rosetta(DE3)中經(jīng)IPTG誘導后獲得包涵體表達。Western blotting證實獲取的重組蛋白是目的蛋白。經(jīng)ELISA檢測獲取的高效價重組抗體。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Aa-Yc基因的S2細胞系基因組DNA，經(jīng)PCR鑒定并確定建立可穩(wěn)定表達rAa-Yc的S2細胞系。rAa-Yc的抗凝血作用結(jié)果顯示：rAa-Yc對PT、TT與APTT均無延時效應(yīng)；血小板聚集抑制檢測發(fā)現(xiàn)，rAa-Yc在0.0064-200ng/μl對ADP誘導的血小板聚