一年生貢氏假鰓鳉載脂蛋白E基因的克隆與表達(dá).pdf

1、近年來,與衰老相關(guān)的研究越來越成為當(dāng)今生物研究的熱點。壽命的決定因素是多方面的,涉及到復(fù)雜的過程,以至于其中大部分的機(jī)制還未完全理解。主要原因是由于研究的模式動物的生命周期長,不利于研究等,嚴(yán)重阻礙了研究衰老的進(jìn)程。由于近年來,對魚類的衰老研究表明,哺乳類衰老相關(guān)的標(biāo)記也適用于魚類,如脂褐素(lipofuscin)、β-半乳糖苷酶(β-galatosidase)和神經(jīng)退變(neurodegeneration),均會隨年(月)齡的增加而上

2、升；人類衰老相關(guān)基因,如IGF-1R、MTP、p66shc和SIRT1等也被證實在魚類中存在。隨后,研究者發(fā)現(xiàn)了新的衰老模式生物一年生假鰓鳉屬。本實驗室已有成熟的飼養(yǎng)貢氏假鰓鳉的實驗條件,而且貢氏假鰓鳉壽命也只有一年左右,便于進(jìn)行相關(guān)衰老方面的研究。載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)是載脂蛋白家族中一員,是血漿極低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、乳糜微粒(CM1)等脂蛋白的組分,能夠與低密度脂蛋白受體

3、結(jié)合,在血漿膽固醇和甘油三脂的代謝中發(fā)揮作用,近些年研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E與阿爾茨海(Alzheimerdisease,AD)、腦血管疾病、糖尿病的并發(fā)癥等多種疾病相關(guān),載脂蛋白E基因被認(rèn)為是衰老基因的一種。
　　 本文首先成功分離克隆出貢氏假鰓鳉載脂蛋白E基因序列全長,并對其進(jìn)行序列分析。分析結(jié)果表明該序列全長1018bp,最大開放閱讀框798bp,編碼262個氨基酸,其中包括N端18個氨基酸組成的信號肽,C端196個氨基酸組成的

4、載脂蛋白結(jié)構(gòu)域,是一種富含堿性氨基酸的的堿性蛋白。成熟蛋白是由245個氨基酸組成的多肽鏈,其中包括33個密碼子塊(33-codon block)和多個由11個或22個氨基酸組成的重復(fù)單位,這些重復(fù)單位可能是形成二級結(jié)構(gòu)α-螺旋所必需的。具有相當(dāng)保守的受體位點區(qū)域,且也富含堿性氨基酸。這些都與其他物種的載脂蛋白E結(jié)構(gòu)極為相似。同源分析結(jié)果表明,貢氏假鰓鯔載脂蛋白E的氨基酸序列與紅鰭東方純載脂蛋白E-1和白斑狗魚載脂蛋白E相似性分別達(dá)到60

5、.7％和48.8％,與爪蟾、鼠類和人類的相似性分別為30.4％、27％和26.2％。該蛋白與其他硬骨魚的載脂蛋白E同源性很高,與爪蟾和哺乳類同源性偏低,這也與其他研究結(jié)果相一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,貢氏假鰓鳉載脂蛋白E和紅鰭東方魨載脂蛋白E-1獨聚一支,而與其他硬骨魚中載脂蛋白E-1聚為一大簇。推測該蛋白可能屬于載脂蛋白E-1家族。
　　 其次,利用實時定量PCR(Real-time Quantity PCR)技術(shù)對該蛋白的組

6、織表達(dá)情況做了研究。分析結(jié)果顯示,貢氏假鰓鳉載脂蛋白E只在肝臟和心臟中表達(dá),在肝臟中表達(dá)極其顯著,這與在人類中的研究結(jié)果基本一致,人血漿的載脂蛋白E約70％是由肝臟合成分泌的。對不同月齡貢氏假鰓鳉該基因的表達(dá)的研究表明,該基因的表達(dá)量隨著月齡的增長而隨之減少。這也與人類衰老相關(guān)標(biāo)記的變化趨勢相一致。由此可見,貢氏假鰓鳉載脂蛋白E可以作為貢氏假鰓鳉的衰老標(biāo)記,為今后利用其進(jìn)行衰老相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 綜上所述,貢氏假鰓鳉是一種