mTOR通路調(diào)控早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞在氧化細胞損傷和修復(fù)中的作用及機制.pdf

1、目的：研究不同濃度及時間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況；進一步探究雷帕霉素干預(yù)后不同濃度及時間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況；研究小RNA干擾后早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況，同時分析其對mTOR通路上下游主要分子的基因和蛋白表達情況；進一步探究高體積分?jǐn)?shù)氧、雷帕霉素及小RNA干擾對細胞外基質(zhì)各膠原、凋亡相關(guān)基因和促纖維化因子的蛋白表達影響。
　　方法：實驗對象為早產(chǎn)小鼠肺成纖維細胞即L929細胞。將新鮮完全

2、培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21％，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數(shù)目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡，MTT法評估細胞增殖；將含有10nM雷帕霉素的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21%，40%，60%，90%的氧濃度暴露3、7、14天后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數(shù)目變化，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡，MTT法評估細胞增殖；通過小RNA干擾將細

3、胞分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組，應(yīng)用MTT法評估兩組細胞的增殖情況，Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測兩組細胞的凋亡情況，應(yīng)用Western blot法檢測mTOR通路上下游主要分子mTOR、4EBP1、P70S6K的蛋白表達情況，應(yīng)用RT-PCR檢測mTOR通路上下游主要分子mTORC1、4EBP1、P70S6K的基因水平，了解早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞在氧化性細胞損傷和修復(fù)中的作用及mTOR信號通路機制；將細胞分為90%氧濃度組、轉(zhuǎn)

4、染組、90%氧濃度+雷帕霉素組和對照組，應(yīng)用ELISA法檢測細胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的水平，應(yīng)用Western blot法檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2和P53的蛋白表達情況，應(yīng)用Western blot法檢測促纖維化因子CTGF和TGF-β的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.高濃度氧干預(yù)的結(jié)果
　　a.高氧暴露后L929細胞增殖活性減弱，且隨著氧濃度和氧暴露時間的延長L929細胞增殖活性減弱越明顯，與空氣對

5、照組比較具統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；高氧暴露后抑制細胞增殖，抑制率隨氧濃度和暴露時間延長而增加。
　　b.高氧暴露后加速L929細胞凋亡壞死，隨著氧濃度和氧暴露時間的延長L929細胞凋亡率增加，與空氣對照組比較具統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　c.高氧暴露后細胞胞體折光率降低，胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，細胞生長不均勻，狀態(tài)欠佳，細胞數(shù)量隨氧濃度和氧暴露時間的延長而減少。
　　2.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后的結(jié)果

6、　　a.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后L929細胞增殖活性明顯減弱，且隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長L929細胞增殖活性減弱越明顯，與空氣+雷帕霉素組比較具顯著性差異(P<0.01)；60%的高氧暴露后增殖抑制更明顯；雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后可抑制細胞增殖，其抑制率隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而增加。
　　b.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后加速L929細胞凋亡壞死，隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長 L929細

7、胞凋亡率增加，與空氣對照組比較具統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　c.雷帕霉素和高濃度氧共同干預(yù)后細胞胞體折光率降低，胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，細胞生長不均勻，狀態(tài)欠佳，細胞數(shù)量隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而減少。
　　3.mTORsiRNA干擾對L929細胞增殖、凋亡及mTOR信號通路上下游分子的蛋白和mRNA表達結(jié)果
　　a.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的蛋白表達下降，與非

8、轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　b.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組mTORC1、P70S6K和4EBP1的mRNA表達下降，與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　c.mTORsiRNA干擾后轉(zhuǎn)染組L929細胞增殖活性減弱，與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)；mTORsiRNA干擾后抑制L929細胞增殖，其抑制率為26.71%。
　　d.mTORsiRNA干擾后可加速L929細胞凋亡，與

9、與非轉(zhuǎn)染組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　4.高濃度氧、雷帕霉素及mTORsiRNA干預(yù)對L929細胞外基質(zhì)影響的結(jié)果
　　a.與空氣對照相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組肺成纖維細胞的細胞外基質(zhì)中col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空氣對照組相比，轉(zhuǎn)染組的col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　b.與空氣對照相比，90%高氧組、

10、90%高氧+雷帕霉素組、轉(zhuǎn)染組肺成纖維細胞的bcl-2蛋白表達減少，P53蛋白表達增加，差異有顯著性(P<0.01)。
　　c.與空氣對照組相比，90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組的CTGF和TGF-β蛋白表達均升高，轉(zhuǎn)染組的CTGF和TGF-β蛋白表達均下降，差異有顯著性(P<0.01)；
　　結(jié)論：
　　1.單純高濃度氧作用于體外培養(yǎng)的早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞時， 可抑制其增殖，加速凋亡。
　　2.雷帕霉

11、素可抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖，加速凋亡，其可能的機制是通過mTOR信號通路。
　　3.mTORsiRNA可抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖，加速凋亡。
　　4.雷帕霉素、mTORsiRNA抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞增殖的可能機制是通過mTOR信號通路，特異性地抑制早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞中mTORC1、4EBP1和P70S6K蛋白及mRNA的表達。
　　5.90%濃度高氧、雷帕霉素均可促進高氧暴露后早產(chǎn)小鼠肺成纖維細胞的col-Ⅰ、

12、col-Ⅲ和FN增多，阻斷其增多的可能機制是通過mTOR信號通路的調(diào)節(jié)。
　　6.Bcl-2是抗凋亡因子，可抑制肺成纖維細胞凋亡；P53是促凋亡因子，可促進肺成纖維細胞凋亡。90%濃度高氧、雷帕霉素、mTORsiRNA轉(zhuǎn)染均可促進肺成纖維細胞凋亡。
　　7.CTGF和TGF-β在氧化細胞損傷BPD肺纖維化時促纖維化作用的可能機制是通過mTOR信號通路，即mTOR信號通路通過促進CTGF和TGF-β的表達促進早產(chǎn)鼠肺成纖維細胞